基于ROS/PI3K/Akt信号通路探讨异牛肝菌素对人胃癌BGC-823细胞凋亡影响及机制

徐彦楠，赵俊霞，周娜静，高 品，周晨明

(1.河北医科大学教学实验中心，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学细胞生物教研室，河北 石家庄 050017;3.河北医科大学大型科研仪器设备共享服务平台，河北 石家庄 050017)

胃癌是世界范围内发病率最高的消化道恶性肿瘤之一，5年相对生存率仅约为20%，早期胃癌临床无明显症状，随着疾病进展逐渐出现消化不良、胃脘疼痛、呕血等症，晚期患者常伴腹部肿块、远处淋巴结转移等体征，放、化疗等方式虽可有效治疗胃癌，但易产生脱发、骨髓抑制等严重不良反应，寻求安全、有效的抗肿瘤药物迫在眉睫[1-2]。肿瘤细胞凋亡减少是恶性肿瘤的病理学基础之一，诱导细胞凋亡是抗肿瘤治疗最有效的途径，本课题组前期研究结果显示，从褐环黏盖牛肝菌子实体中分离纯化的异牛肝菌素(iso-suillin)可有效抑制细胞增殖、诱导人肝癌细胞SMMC-7721细胞及人小细胞肺癌H446细胞凋亡，且与人胃癌BGC-823细胞增殖、凋亡密切相关[3-4]。当细胞代谢异常产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)超过抗氧化系统的还原能力时，细胞处于氧化应激状态，易引起凋亡相关基因的表达，继而激活细胞凋亡程序[5]。有研究证实，ROS的生成在多种抗肿瘤药物的促凋亡活性中有重要作用，而PI3K/Akt信号通路参与机体细胞存活、周期、凋亡、物质代谢等生物学过程，与多种肿瘤细胞的凋亡息息相关[6-7]。本课题拟通过观察iso-suillin对人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白、ROS/PI3K/Akt信号传导通路相关蛋白表达的调控作用，进一步阐明iso-suillin对人胃癌BGC-823细胞促凋亡的作用及分子机制，为iso-suillin成为一种潜在的抗肿瘤药物提供基础实验依据和参考，现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 人胃癌细胞系BGC-823细胞保存于河北医科大学细胞生物教研室。

1.2主要药物与试剂 异牛肝菌素(河北师范大学生命科学院)，胎牛血清(美国Gibco公司)，青霉素(上海江莱生物科技有限公司)，链霉素(深圳华药南方制药有限公司)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基(美国Invitrogen Life Technologies公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液(天津科密欧化化学试剂公司)，多聚甲醛、磷酸缓冲液(天津永大化学试剂开发中心)，Hoechst染色液(美国Amresco公司)，苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSE)细胞裂解液(美国Cell Signaling Technology公司)，兔抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、PI3K、Akt、mTOR(美国Bioworld Technology公司)，山羊抗兔二抗(康为世纪生物试剂公司)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Amresco公司)。

1.3主要仪器设备 普通显微镜(日本Olympus公司)，QP-80S二氧化碳培养箱(山东博科医疗器械有限公司)，医用冰箱(青岛海尔医用低温有限公司)，EV261电泳仪(比利时Consort公司)，荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，微量移液器(上海赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.4细胞培养 配制内含10%胎牛血清、10 g/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI培养基，将人胃癌BGC-823细胞置于RPMI培养基中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每隔24 h换液一次。待细胞形成致密单层后分瓶培养：弃去培养基，用磷酸缓冲液清洗1次后加入5 mL 0.04%的EDTA消化液，沿同一方向轻轻摇动培养瓶，待消化液充分浸润后于显微镜下观察。若多数细胞形态变圆，弃去EDTA消化液后加入10 mL新鲜RPMI培养基终止消化，而后反复吹打使细胞形成细胞悬液，以1∶2传代培养，3 d传代1次。

1.5方法

1.5.1Hoechst 33342荧光染色观察人胃癌BGC-823细胞形态学变化 取培养至对数生长期的人胃癌BGC-823细胞，在细胞培养瓶中调整胞悬液使浓度为1×105个/mL，于96孔细胞培养板中接种，每组均设置3个复孔，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h。分别加入7 μmol/L、14 μmol/L、28 μmol/L浓度的异牛肝菌素处理，依次记为低剂量组、中剂量组、高剂量组；另取一组记为对照组，给予等量生理盐水处理，处理完毕后均在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下继续培养48 h，终止培养。弃去上清液后采用磷酸缓冲液洗涤1次，并用4%多聚甲醛固定，30 min后再使用磷酸缓冲液洗涤3次，使用微量移液器吸净液体后加入Hoechst染色液，于室温下染色15 min后去除染液，再使用磷酸缓冲液洗涤3次后使用吸净微量移液器液体，每孔加入适量荧光淬灭剂，于荧光显微镜下观察。细胞凋亡率=凋亡细胞数量/总细胞数量×100%。

1.5.2蛋白免疫印迹法检测异牛肝菌素处理后人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白的表达水平 分组及细胞处理同1.5.1，将不同浓度异牛肝菌素作用于人胃癌BGC-823细胞48 h后弃去培养液，磷酸缓冲液洗涤2次，并用微量移液器吸净多余液体；加入80～120 μL细胞裂解液(PMSE与细胞裂解液按1∶100混合)，于4 ℃条件下裂解30 min，分别提取各组细胞总蛋白。将样本与2倍浓度上样缓冲液以体积1∶1混合，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(分离胶为12%)后转至PVDF膜，采用含0.1% Tween的5%脱脂奶粉于室温下封闭2 h后进行洗膜，洗膜后加入1∶500稀释的兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase -9孵育，于4 ℃条件下过夜，TBST缓冲液洗涤3次后，采用山羊抗兔IgG抗体(1∶1 000，二抗)标记，将漂洗过的PVDF膜置于孵育盒中，37 ℃温箱中孵育1 h，将PVDF膜置于凝胶成像系统中进行发光等操作，采用凝胶图像分析软件测定各蛋白条带的积分光密度值(integrated optical density，IOD)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9蛋白条带的IOD与对应的β-actin条带光密度比值为Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9的表达的相对水平，重复3次，取平均值。

1.5.3活性氧荧光探针染色法(Dichlorfoluorescein diacetate，DCFH-DA)检测异牛肝菌素处理后人胃癌BGC-823细胞ROS水平 取处于对数生长期的人胃癌BGC-823细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成5×107的单细胞悬液，于96孔细胞培养板中接种，每组均设置3个复孔，细胞贴壁后弃去培养液，加不同浓度异牛肝菌素干预48 h，采用磷酸缓冲液洗涤2次，加入DCFH-DA染色液，于37 ℃恒温细胞培养箱内孵育30 min，用预冷的磷酸缓冲液洗涤3次，于倒置荧光显微镜下(发射波长为530 nm)观察。

1.5.4蛋白免疫印迹法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平 检测方法同1.5.2，其中一抗为兔抗人PI3K、Akt、mTOR，二抗选用山羊抗兔IgG抗体标记。

1.6统计学方法 应用SPSS 24.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1干预后各组人胃癌BGC-823细胞形态学变化 Hoechst 33342荧光染色显示随着异牛肝菌素浓度增加，呈亮蓝色的细胞越来越多，染色质凝聚，出现凋亡小体，即细胞凋亡。与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 不同浓度iso-suillin干预后各组凋亡率比较Table 1 Comparison of apoptosis rate in each group after intervention with iso-sullin at different concentrations

图1 各组人胃癌BGC-823细胞形态学变化(Hoechst33342荧光染色 ×200)

2.2干预后各组人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白表达水平 干预后，蛋白免疫印迹法检测异牛肝菌素对人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白结果显示，与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相对表达量均增加，抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 不同浓度iso-suillin干预后人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of expression levels of apoptosis-related proteins in human gastric cancer BGC-823 cells after intervention with iso-sullin at different concentrations

图2 各组人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白表达水平

2.3干预后各组人胃癌BGC-823细胞ROS水平 干预后，DCFH-DA检测异牛肝菌素处理后人胃癌BGC-823细胞ROS水平结果显示，随着异牛肝菌素浓度的增加，人胃癌BGC-823细胞ROS细胞浆着色密度增加，提示ROS水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组人胃癌BGC-823细胞ROS水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图3。

表3 不同浓度iso-suillin干预后各组人胃癌BGC-823细胞ROS水平比较Table 3 Comparison of ROS level of human gastric cancer BGC-823 cells in each group after the intervention with iso-sullin at different concentrations

图3 各组人胃癌BGC-823细胞ROS水平(活性氧荧光探针染色法 ×200)

2.4PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平 干预后，蛋白免疫印迹法检测异牛肝菌素处理后人胃癌BGC-823的PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达结果显示，与对照组比较，随着异牛肝菌素浓度的增加， 低剂量组、中剂量组、高剂量组PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图4。

表4 不同浓度iso-suillin干预后各组PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of PI3K/Akt signal pathway-related protein expression levels in each group after the intervention with iso-sullin at different concentrations

图4 PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平

3 讨 论

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌发病率、病死率接近全球范围内胃癌发病及病死总数的50%，严重威胁居民生命健康[8]。既往研究表明，胃癌恶性程度较高，确诊时多数处于中晚期，手术、放疗、生物治疗等虽可缓解胃癌患者临床症状，但伴随着严重的不良反应、肿瘤耐药等问题，患者临床预后欠佳，已成为制约胃癌治疗的瓶颈[9]。因此，寻找高效、毒性低的抗肿瘤药物尤为关键。基因突变引起细胞内信号传导紊乱导致的细胞增殖失控、细胞凋亡受阻是致使胃癌发生的主要因素，细胞凋亡可通过处理衰老、受损的细胞维持组织内稳态环境，但在退行性条件下，凋亡系统被破坏易致癌症、自身免疫性疾病等症，目前临床多数抗肿瘤药物通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗目的[10]。iso-suillin是从褐环黏盖牛肝菌子实体中分离纯化得到的异戊二烯基酚类化合物，具有抗氧化、提高机体耐受力等多种药用价值，同时可诱导部分肿瘤细胞凋亡，毒不良反应低于顺铂等传统抗肿瘤药物。Zhao等[11]研究显示，异牛肝菌素可通过线粒体介导的内在途径及死亡受体介导的外在途径调节Caspases家族相关蛋白的表达，继而诱导肿瘤细胞凋亡，可作为胃癌、心脑血管肿瘤等疾病的潜在治疗方法。

为明确iso-suillin对胃癌细胞凋亡的影响，本研究将异牛肝菌素作用于人胃癌BGC-823细胞，通过Hoechst 33342荧光染色实验显示，随着异牛肝菌素浓度增加，呈亮蓝色的细胞越来越多，染色质凝聚，出现凋亡小体，且呈现剂量依赖性，证实异牛肝菌素可诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。通过蛋白免疫印迹法进一步对人胃癌BGC-823细胞凋亡相关蛋白检测显示，与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组促凋亡蛋白Bax相对表达量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量降低，此外，Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9相对表达量均增加，证实肿瘤细胞发生了线粒体凋亡。Bax是Bcl-2家族经典的促凋亡因子，可在线粒体外膜成孔，破坏线粒体后增加细胞色素C的释放，最终激活Caspase -9，致使肿瘤细胞凋亡。此外，细胞内源性凋亡起始于DNA破坏或细胞受损，外源性凋亡起始于细胞外配体或死亡受体间相互作用，二者均依赖于Caspase家族成员的激活，其中Caspase-3可通过自我催化引起蛋白酶级联反应，特异性裂解底物而致细胞凋亡；Caspase-8可诱导死亡配体与其特异性受体结合，形成诱导死亡信号复合体而促使肿瘤细胞凋亡[12-13]。最新研究表明，引起肿瘤细胞代谢异常产生的大量ROS可使细胞处于氧化应激状态，从而激活细胞凋亡程序，在多种抗肿瘤药物的促凋亡活性中有关键作用[14]。Fasoulakis等[15]学者研究显示，细胞内ROS水平增加可将肿瘤细胞周期阻滞在G1期、诱导细胞凋亡，ROS介导的死亡受体上调而增加肿瘤坏死因子相关凋亡受体发挥作用，在胃癌、膀胱癌、肝癌等恶性肿瘤中均有显著作用。本研究通过DCFH-DA检测异牛肝菌素处理后人胃癌BGC-823细胞ROS水平亦显示，iso-suillin可通过增加细胞ROS水平诱使肿瘤细胞代谢异常，继而促使细胞凋亡。PI3K作为细胞内的磷脂酰肌醇激酶，本身具有丝氨酸的活性，在接受酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体信号后，自身发生磷酸化，使Akt从细胞质转移至细胞膜上，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节[16-17]。本研究通过蛋白免疫印迹法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平显示，PI3K、Akt、mTOR蛋白活性是被抑制的，进一步显示Akt下游相关蛋白活性也被抑制，且促使肿瘤细胞凋亡，推测可能与PI3K、Akt迅速失活有关，哺乳动物细胞凋亡多为级联反应，异牛肝菌素可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，诱导人胃癌BGC-823细胞发生凋亡，但其是否还通过其他机制致使胃癌细胞死亡还有待进一步研究。

综上所述，iso-suillin可诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡，发生机制可能与活化了Caspase家族蛋白、上调了ROS表达、下调PI3K、Akt、mTOR相关。但其是否同时通过其他机制诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡还需深入研究。