血清外泌体Glypican-1在乳腺癌中的表达水平及临床应用价值

郭奕阳，马伟丽，曹诗茹，郭秀娟，邓艳丽，张金艳*

(1.河北医科大学第四医院检验科，河北 石家庄 050011；2.河北省胸科医院分子生物学实验室，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学第四医院肿瘤研究所，河北 石家庄 050011)

全球范围内，乳腺癌的医疗负担都在增加，位居中国女性癌症发病率第一位[1]。依靠敏感度高、特异度强的生物标志物可以提高早期诊断率，同时实施安全有效的精准治疗可以提高存活率[2-3]。但是，现阶段仍然缺乏乳腺癌早期诊断的生物标志物[4]。外泌体是一种广泛存在于体液，如血浆、尿液、唾液中的分泌小囊泡[5]。乳腺癌细胞分泌的外泌体在细胞增殖、细胞转移、血管生成和免疫应答等方面发挥调节作用[6]。通过分析乳腺癌细胞系MDA-MB-231和非癌性乳腺细胞系MCF-10A的外泌体蛋白质组差别，发现血清外泌体膜蛋白Glypican-1有作为乳腺癌早期诊断标志物的潜在价值[7]。本实验采用临床样本对血清外泌体膜蛋白Glypican-1进行进一步的检测与研究。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年4—7月因新发乳腺肿块于河北医科大学第四医院就诊的患者66例，均由病理组织学检查确诊，其中乳腺良性占位18例，乳腺癌48例，所有患者之前均未经任何治疗。另收集与其相匹配的同时期于河北医科大学第四医院体检的健康查体者17名，为健康对照组。

本研究经医院伦理委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2血清外泌体提取及鉴定

1.2.1制备血清 所有研究对象均于空腹状态下采集4 mL外周静脉血，待自然凝固后，离心取血清，-80 ℃保存备用。

1.2.2血清外泌体提取及鉴定 采用聚乙二醇沉淀法提取血清外泌体，取0.5 mL待检血清，加入120 μLPEG 8 000工作液，充分混匀，4 ℃静置30 min，1 500 g离心30 min，弃上清，再次1 500 g 离心5 min，吸出残液，所得沉淀即所需外泌体，经透射电子显微镜观察外泌体形态和Western blot检测外泌体表面蛋白标记物CD9后，-80 ℃冻存。

1.3血清外泌体GPC-1的检测 采用Western blot检测乳腺癌组、乳腺良性占位组和健康对照组血清外泌体GPC-1的表达水平，及乳腺癌组治疗前后血清外泌体GPC-1表达水平。

1.4临床数据整理 收集乳腺良性占位组和乳腺癌组血清肿瘤标志物、乳腺超声、钼靶和病理组化结果，并进行整理总结。

1.5统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据，非正态分布计量资料采用Kruskal-Wallis H检验、Wilcoxon秩和检验，正态分布的计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线评价血清外泌体GPC-1对乳腺癌的诊断价值。以病理诊断为金标准，计算血清外泌体GPC-1、血清肿瘤标志物、超声、钼靶射线四种诊断方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，采用Kappa一致性检验评价四种诊断方法对乳腺癌的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1血清外泌体形态及分子鉴定 使用PEG8000 沉淀法提取血清外泌体，透射电镜下观察外泌体呈杯托样，直径约为100 nm(图1)。Western blot检测血清外泌体标记蛋白，可见CD9的表达条带(图2)。结果证明所提取的沉淀物为外泌体。

图1 血清外泌体形态

图2 血清外泌体CD9表达

2.2三组标本间血清外泌体GPC-1的表达水平差异 Western blot检测乳腺癌组、乳腺良性占位组和健康对照组血清外泌体GPC-1表达水平，55kDa左右可见明显条带(图3)，对蛋白条带灰度分析后可得，三组间血清外泌体GPC-1表达水平不全相同，乳腺癌组血清外泌体GPC-1表达水平[1.065(0.501)]高于乳腺良性占位组[0.652(0.711)]和健康对照组[0.625(0.117)]，差异有统计学意义(H=32.051，P<0.05)。

图3 血清外泌体GPC-1表达

2.3血清外泌体GPC-1对乳腺癌的诊断价值 以病理检查结果为金标准，利用ROC曲线评估血清外泌体GPC-1检测结果对乳腺癌的诊断价值。结果显示，ROC曲线下面积(AUC)为0.900(95%CI:0.833～0.967)，最佳截断值为0.961，即血清外泌体GPC-1值≥0.961时诊断为乳腺癌，此时诊断的敏感度为72.9%，特异度为97.1%(图4)。

图4 血清外泌体GPC-1诊断乳腺癌的ROC曲线

2.4乳腺癌组血清外泌体GPC-1在不同临床及病理特征组的比较 根据乳腺癌组血清外泌体GPC-1表达水平，以最佳截断值为0.961为界，将48例乳腺癌患者分为GPC-1阳性组和GPC-1阴性组，分析其表达水平和患者临床特征的关系。结果显示GPC-1阳性在不同TNM分期组、淋巴结浸润组和Ki-67高表达组间差异有统计学意义(P均<0.05),在不同患者年龄、月经、远端转移和HER-2表达组间差异无统计学意义(P均>0.05),见表1。

表1 血清外泌体GPC-1表达水平在不同临床及病理特征的组间的比较Table 1 Comparison of expression level of serum exosomal GPC-1 in different clinical pathological characters groups (例数，%)

2.5乳腺癌组治疗前后血清外泌体GPC-1的表达水平差异 Western blot检测乳腺癌组治疗20 d前后的GPC-1表达水平，经蛋白条带灰度分析后可得，治疗前血清外泌体GPC-1表达水平[1.065(0.501)]高于治疗后血清外泌体GPC-1表达水平[0.844(0.195)]，差异有统计学意义(Z=856.000，P=0.006)。

2.6血清外泌体GPC-1、血清肿瘤标志物、乳腺超声、钼靶四种检测方法对乳腺癌诊断价值的分析 以病理检查结果为金标准，分别用血清外泌体GPC-1、血清肿瘤标志物、乳腺超声、钼靶诊断乳腺良性占位组和乳腺癌组共66例患者，四种检测方法的诊断结果见，见表2。并分别对四种检测方法与金标准病理检查结果做Kappa一致性检验，血清外泌体GPC-1检测方法的Kappa值为0.485>0.4，与病理检查比较一致性中等，且优于其他3种检测方法，见表3。

表2 乳腺癌四种检测方法的诊断结果Table 2 The results of four detection methods in the diagnosis of breast cancer (例数)

表3 乳腺癌四种检测方法的一致性检验Table 3 Consistency test of the four detection methods for breast cancer

3 讨 论

Glypicans是硫酸类肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)家族一员，通过C末端的糖基磷脂酰肌醇连接到细胞膜外膜[8],GPCs家族通常分为六种(GPC-1～GPC-6)[9]。GPC-1在胰腺癌[10]，胶质瘤[11]，食管癌[12]等多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤细胞的增殖、转移和血管生成密切相关[12-13]。外泌体由体内多种细胞分泌而来，可进入外周血循环[14]。外泌体检测具备标本易采集、稳定，能够实时动态检测和反映分泌细胞生物学特性等优势[15]。有研究通过免疫组化法对220例乳腺癌患者GPC-1表达水平进行检测，发现乳腺癌组织中GPC-1高表达与正常组织比较差异有统计学意义，且在乳腺癌晚期和大直径肿瘤的患者中，GPC-1表达显著升高[16]。本研究通过检测乳腺癌组、乳腺良性占位组和健康对照组血清外泌体GPC-1表达水平，发现乳腺癌组血清外泌体GPC-1水平高于乳腺良性占位组和健康对照组，与以往检测乳腺组织的实验结果保持一致，证明血清外泌体中的GPC-1可以准确的反应乳腺组织细胞的变化，筛查乳腺癌患者，具有乳腺癌早期诊断的潜力的。Matsuda等[17]研究发现GPC-1的表达可以增强乳腺癌细胞系对不同肝素结合生长因子促有丝分裂和细胞增殖的反应，表明GPC-1的上调在乳腺癌进展中发挥作用。此外,MDA-MB-231乳腺癌细胞系GPC-1基因的表达使其更具有转移潜力[18]。本研究通过分析乳腺癌组48例患者血清外泌体GPC-1表达水平与临床特征的关系，发现GPC-1阳性与TNM分期、淋巴结浸润和Ki-67高表达显著相关，且GPC-1表达水平越高，肿瘤TNM分期越晚，呈正相关性。同时，我们对乳腺癌组治疗20 d前后的血清外泌体GPC-1表达水平进行比较，发现治疗后血清外泌体GPC-1表达水平下降且差异有统计学意义。血清外泌体GPC-1高表达与不良预后相关，且对治疗反应敏感，可对乳腺癌的临床诊断和预后评估提供参考。

本研究以病理检查结果为金标准，构建了血清外泌体GPC-1诊断乳腺癌的ROC曲线，ROC曲线下面积为0.900，提示其可以作为乳腺癌的诊断标志物。血清外泌体GPC-1、血清肿瘤标志物、乳腺B超、钼靶四种乳腺癌检测方法一致性检验显示血清外泌体CPC-1检测结果与病理检查结果一致性最高，敏感度高于血清肿瘤标志物，特异度高于乳腺B超和钼靶，提示乳腺癌早期筛查可以将血清肿瘤标志物和血清外泌体GPC-1联合应用，提高检出率。影像学方法不易发现肿瘤患者早期病变且仪器场地限制不适合早期大规模筛查，而血清外泌体GPC-1检测弥补了该方法的不足。

综上所述，本研究发现血清外泌体GPC-1对乳腺癌的诊断有一定辅助价值，同时本研究也存在不足之处，标本量较少，下一步我们将深入研究外泌体来源的GPC-1在乳腺癌的作用机制，收集数据进行生存分析，进一步分析其在预后中的价值。