外周血自噬基因Benlin-1表达联合APACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的研究

王 佳，高恒波，林雪容，罗肖宇，陈丽君，韩树池

(1. 河北北方学院附属第一医院急诊科，河北 张家口075000；2. 河北医科大学第二医院急诊科，河北 石家庄050000)

急性生理和慢性健康评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)是评价脓毒症预后的常用指标[1-3]。新近的研究认为免疫功能抑制、自噬、内质网应激、凋亡等环节与脓毒症的发生发展密切相关[4-6]。淋巴细胞是重要的免疫细胞，有动物实验报道，激活自噬能够促进脓毒症小鼠体内CD4+T淋巴细胞的存活[7]；另有临床研究证实，脓毒症患者外周血淋巴细胞中自噬基因Beclin-1的表达明显减少且与病情加重、预后恶化有关[8-9]，提示淋巴细胞自噬减弱是影响脓毒症预后的可能因素。本研究旨在探索Beclin-1联合APACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的价值。旨在为临床评价脓毒症的病情及预后提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月—2019年10月期间河北北方学院附属第一医院收治的脓毒症患者238例作为脓毒症组，入组标准：①符合《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)》[10]中脓毒症的诊断标准；②入院后即刻留取外周静脉血标本；③临床资料完整。排除标准：①合并恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫功能缺陷疾病；②入院前正在使用免疫抑制剂或糖皮质激素治疗；③妊娠及哺乳。另取同期体检健康者104例作为对照组。脓毒症组中男性131例、女性107例，年龄45～72岁、平均(56.38±8.85)岁；对照组中男性59例、女性45例，年龄40～68岁、平均(55.29±8.45)岁。2组一般资料比较差异有统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究取得医院伦理委员会批准。

1.2试剂与仪器 淋巴细胞分离液、RIPA裂解液、BCA试剂盒均为上海碧云天公司，Beclin-1一抗为美国Abcam公司，β-actin一抗为美国Sigma公司，电泳系统及凝胶成像系统为上海天能公司。

1.3方法

1.3.1外周血Beclin-1表达的检测 取脓毒症组和对照组的外周静脉血5 mL，采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，而后加入RIPA裂解液裂解淋巴细胞、提取蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白含量，将含有30 μg蛋白的样本用于Western blot实验。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温孵育PVDF膜1 h，1∶1 000稀释的Beclin-1一抗或1∶2 500稀释的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜过夜，洗膜3次后室温孵育1∶2 000稀释的二抗1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，根据条带灰度值、以β-actin为内参计算Beclin-1的表达水平。

1.3.2收集临床资料 查阅脓毒症患者的病历，收集以下临床资料：性别，年龄，既往病史(高血压、糖尿病)，生命体征(体温、收缩压、舒张压)，入科24 h的实验室检查指标[白细胞计数(white blood cell，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板计数(platelet count，PLT)、白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)，根据入院后24 h内各项指标的最差值计算APACHEⅡ]。

1.3.3预后情况判断 查阅脓毒症患者的病历，根据入科后28 d的病情判断预后，包括存活和死亡，自动出院或临终前放弃的患者均视作死亡。

1.4统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验、秩和检验，计数资料比较采用χ2检验；预后的比较采用Kaplan-Meier曲线分析及ROC曲线分析，预后的影响因素采用COX模型分析，联合指标的生成采用Logistic回归模型分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1脓毒症组与对照组外周血Beclin-1表达的比较 与对照组比较，脓毒症患者外周血中Beclin-1的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

图1 脓毒症组与对照组外周血Beclin-1表达的蛋白电泳图

表1 脓毒症组与对照组外周血Beclin-1表达的比较Table 1 Comparison of beclin-1 expression in peripheral blood between sepsis group and control group

2.2外周血Beclin-1预测脓毒症患者28 d病死的Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析 按照脓毒症组患者外周血Beclin-1表达的中位数将其分为高表达患者和低表达患者，经Kaplan-Meier曲线分析，与Beclin-1高表达患者比较，低表达患者的28 d累积病死率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。绘制外周血Beclin-1表达预测脓毒症患者28 d病死的ROC曲线，曲线下面积为0.5947(95%CI：0.5210～0.6683，P=0.015)。见图2。

图2 外周血Beclin-1预测脓毒症患者28 d病死的Kaplan-Meier曲线及ROC曲线A.外周血Beclin-1预测脓毒症患者28 d病死的Kaplan-Meier曲线;B.外周血Beclin-1预测脓毒症患者28 d病死的ROC曲线Figure 2 Kaplan-Meier curve and ROC curve of Beclin-1 in peripheral blood in predicting 28-day mortality in patients with sepsis图3 APACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的Kaplan-Meier曲线及ROC曲线A.APACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的Kaplan-Meier曲线;B.A-PACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的ROC曲线

2.3APACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析 按照脓毒症组患者APACHEⅡ评分分为<15分患者、15～25分患者、>25分患者，经Kaplan-Meier曲线分析，与APACHEⅡ评分分为<15分及15～25分患者比较，APACHEⅡ评分>25分患者的28 d累积病死率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。绘制APACHEⅡ评分预测脓毒症患者28 d病死的ROC曲线，曲线下面积为0.5861(95%CI：0.511～0.661，P=0.027)。

2.4脓毒症组中存活患者与病死患者临床资料的比较 与脓毒症中存活患者比较，病死患者的性别、年龄、高血压、糖尿病、体温、舒张压、WBC、Hb、PLT、ALB、ALT、AST、CRP差异无统计学意义(P>0.05)， Cr、PCT、APACHEⅡ评分明显增加，收缩压、Beclin-1表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 脓毒症组中存活患者与死亡患者临床资料的比较Table 2 Comparison of clinical data between survival patients and dead patients in sepsis group

2.5脓毒症患者28 d病死影响因素的COX回归分析 以脓毒症组患者预后作为应变量(存活=0、病死=1)，以Beclin-1、APACHEⅡ、收缩压、Cr、PCT作为连续自变量，进行COX回归分析可知Beclin-1、APACHEⅡ评分是脓毒症组患者预后的影响因素，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 脓毒症患者28 d病死影响因素的COX回归分析Table 3 COX regression analysis of influencing factors of 28-day mortality of sepsis patients

2.6外周血Beclin-1与APACHEⅡ评分联合指标预测脓毒症患者28 d病死的Logistic回归与ROC曲线联合分析 在Logistic回归模型中生成Beclin-1联合APACHEⅡ评分预测脓毒症组患者预后的新指标方程为：-0.566-2.238×Beclin-1+0.065×APACHEⅡ评分。该联合指标预测脓毒症患者28 d病死的ROC曲线下面积为0.6452(95%CI：0.5694～0.7211，P<0.001)。见图4。

图4 外周血Beclin-1与APACHEⅡ评分联合指标预测脓毒症患者28 d病死的ROC曲线

3 讨 论

脓毒症是重症医学领域的研究热点，救治难度大、预后差、病死率高，学者们不仅致力于研究脓毒症发病的病理生理机制，同时也在探索能够准确评估病情及预后的监测指标和方法。APACHEⅡ评分是目前重症医学科应用最广泛的病情评价指标，国内外多项研究已经证实APACHEⅡ评分是脓毒症患者预后的影响因素[10]。虽然APACHEⅡ评分系统涵盖了慢性病、缺氧、炎症、休克等与脓毒症病情相关的因素，但却未能纳入近些年发现与脓毒症发病相关的自噬、内质网应激、凋亡等环节。因此，本研究从新发现的脓毒症病理生理机制切入，寻找新的标志物与APACHEⅡ评分联合评价脓毒症预后，旨在为提高评估脓毒症预后的准确性提供参考。自噬是近些年受到越来越多关注的脓毒症相关病理生理机制[11-13]。自噬是溶酶体降解蛋白质、细胞器并进行再利用的过程，适度的自噬有利于维持细胞稳态，使细胞在感染、应激等病理因素作用下存活。在脓毒症的发病过程中存在免疫功能抑制，多项临床研究证实脓毒症患者外周血淋巴细胞减少且淋巴细胞的自噬减弱[8-9]；另有动物实验研究显示激活自噬能够促进脓毒症小鼠体内淋巴细胞存活[14]，Ying等[15]的研究显示抑制自噬能够促进脓毒症小鼠体内淋巴细胞凋亡。本研究通过检测外周血淋巴细胞中自噬基因Beclin-1的表达来评价淋巴细胞的自噬程度，与对照组比较，脓毒症组外周血中Beclin-1的表达明显减少，与国内的研究结果一致[8-9]，表明脓毒症发病过程中淋巴细胞的自噬受到抑制。

随着脓毒症病情的加重，预后也相应变差、病死率相应升高。研究证实，脓毒症死亡患者外周血中Beclin-1的表达水平低于存活患者[8]；结合已有基础研究证实自噬对淋巴细胞的保护作用进行分析，脓毒症发病过程中淋巴细胞自噬减弱不利于细胞存活、造成淋巴细胞减少及免疫功能抑制，进而导致脓毒症病情加重、病死率增加。本研究进一步采用Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析了Beclin-1表达与脓毒症预后的关系，结果显示与Beclin-1高表达患者比较，低表达患者的28 d累积病死率明显增加且Beclin-1表达对脓毒症患者28 d病死具有预测价值。此结果与Beclin-1介导自噬对淋巴细胞的保护作用吻合，表明Beclin-1表达减少与脓毒症病死率增加有关。

脓毒症预后的影响因素复杂，其中APACHEⅡ评分是目前公认的脓毒症预后影响因素[1-3,16]，本研究中Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析也验证了APACHEⅡ评分对脓毒症患者预后的评估价值。但使用单一指标对预后进行评价仍有一定的局限性，本研究将采用Beclin-1联合APACHEⅡ评分的方式对脓毒症的预后进行评价。经COX回归分析，Beclin-1及APACHEⅡ评分是脓毒症预后的影响因素，在此基础上通过Logistic回归产生Beclin-1联合APACHEⅡ评分的方程、以此作为评价预后的新指标，该新指标对脓毒症患者28 d病死具有预测价值，且预测的ROC曲线下面积优于单一指标。

综上所述，脓毒症患者外周血自噬基因Beclin-1表达减少且与28 d病死率增加有关，Beclin-1联合APACHEⅡ评分用于评估脓毒症患者的预后具有更优的预测价值，为今后评估老年脓毒症病情、研究脓毒症发病机制提供了新思路、新靶点。但是，本研究的样本量相对较少，仍需在今后的研究中继续增加样本量寻找更优的截点以提高联合指标的敏感度和特异度。