电针预处理内关穴对心肌缺血再灌注大鼠自噬调控基因和自噬微管相关蛋白轻链3表达的影响

张燚格，何妙嬴，柳冬冬，李 丹，张程程，ZAIN UR Rehman(巴基斯坦)，王 超

(湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208)

心肌缺血属于中医理论中“胸痹”范畴，临床上主要有胸痛、胸闷、气短、心律失常等表现。本病的典型表现及相关记载出现在较早的古籍中，历代医家在继承前人医学理论的基础上，明确提出胸痹应重扶阳，调气血的观点，确立温阳散寒、补气助阳、通阳宣痹、回阳救逆四种扶阳方法。针刺疗法的传承历史悠久，《内经》中对于胸痹的论治较为简单，多采取刺法，治疗思路多从经论治，常选取手少阴心经、手太阳小肠经腧穴，若兼见其他脏腑症状，取相关经脉进行治疗[1]。心肌缺血再灌注(MIRI)损伤作为引起心血管疾病的关键原因，与冠状动脉闭塞相关疾病具有相关性。缺血再灌注损伤引起的心肌受损是冠状动脉疾病的主要病理表现，其机制是缺血期间积聚的物质与再灌注传递物质之间的相互作用所致。因此，减轻缺血再灌注损伤是改善心肌缺血的重要目的[2-4]。针灸预处理是近年来预防医学领域中一种安全、有效防治疾病的手段。实验研究表明，针灸预处理可以对心、脑、胃肠等部位发生的缺血缺氧形成良好保护作用[5-6]。通过调动人体各种自我反馈和调节机制，启动机体内源性保护机制，发挥预防和治疗保护效果。本课题组前期研究发现，电针预处理内关穴对MIRI模型大鼠具有预保护作用，且电针与艾灸均具有延迟保护作用，这种保护作用还存在时间差异[7-9]。不同时间点电针预处理内关穴对MIRI模型大鼠的影响，缺乏实验观察数据支撑。因此，本文将从不同时间点对针刺时间效应及其变化规律进行初步探讨，寻求最佳针刺时间窗，为临床MIRI预防、治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级的SD雄性大鼠48只，由湖南中医药大学动物实验中心提供[动物合格证SYXK(湘)2019-0004]，饲养温度20～25 ℃，湿度为50%～70%，大鼠体重200～250 g。使用自然光和黑暗交替周期采光，自由获得标准饲料、自来水。实验过程中，对动物的处理遵循科技部颁布的《实验动物管理条例》[10]。

1.1.2 实验仪器：小动物呼吸机 220V(型号HX-101E，成都泰盟软件有限公司)；数字心电图机(型号ECG-2303B，广州市三锐电子科技有限公司)；华佗牌电子针疗仪(型号SDZ-Ⅱ新款，苏州医疗用品有限公司)；荧光定量PCR仪器(型号ABI 7500)；脱水机(型号JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司)；小型板式离心机(批号Minip-2500，杭州米欧仪器有限公司)；酶标检测仪(型号Rt2100c，Rayto公司)；电泳仪(型号DYY-6C，北京六一仪器厂)。

1.1.3 实验试剂：二甲苯(批号10023418，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(批号100092683，国药集团化学试剂有限公司)；超纯总RNA提取试剂盒(批号CW0581S，康为世纪生物科技股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法：以SD大鼠为实验对象，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg进行麻醉，仰卧位固定。术前连接心电图，对心电图不符合标准者不予纳入数据。将大鼠的颈前和胸前区去毛，消毒，气管插管后接小动物人工呼吸机(潮气量20～30 ml/kg、呼吸频率70～80 次/min)。沿胸骨正中线左侧约4～5 mm处切开皮肤，在第3～4肋骨处打开胸部以暴露心脏。沿左侧第4、5肋骨间打开胸腔，心脏打开后，剪开心包膜，抬起左心耳，在冠状动脉左前降支上1/3处穿线并结扎0号线。心电图ST段变化及冠状动脉向外膨胀发绀作为结扎成功的标志。结扎后40 min，松开结扎线，对左前降支进行60 min灌流。每组造模结束后立即从腹主动脉取血3～5 ml，取出心脏。

1.2.2 穴位定位及干预方法：参照《常用实验动物穴位的标准化定位方法研究》[11]中“常用实验动物的针灸穴位”定位法，内关穴位于前肢内侧的尺骨、桡骨缝之间，距腕关节3 mm左右。行提插捻转手法大约1 min后接电针(在穴位旁0.1 cm刺入一辅助针)，疏密波，强度以大鼠能耐受且双上肢轻微颤动为度，持续30 min，1次/d。

1.2.3 检测指标及方法：石蜡切片经烘烤、脱蜡、水化后进行HE染色，脱水、透明、封片后在显微镜下观察心肌组织的病理形态学变化。将心肌组织进行匀浆处理，提取总RNA。参照试剂盒说明书，对RNA进行反转录处理，取0.2 ml的PCR管，制备相应的反应体系进行荧光定量PCR法(qRT-PCR)法。反应条件：95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，共循环40次。用2-△△Ct法对结果进行处理，各基因引物序列见表1。对大鼠心肌组织进行细胞总蛋白提取，采用BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE电泳；转膜，转好的膜用5%脱脂牛奶(0.5%TBST配)。室温下脱色摇床封闭1 h，一抗稀释后在室温下脱色摇床用TBST洗3次，5 min/次。二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30 min后，在室温下脱色摇床用TBST洗3次，5 min/次。凝胶图像分析：PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值情况。

表1 各基因PCR引物序列(5’→3’)

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS 25.0统计学软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示，组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用单因素方差分析，对不符合正态性、方差齐性的资料，采用非参数秩和检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理切片形态学比较 见图1。空白组：心肌纤维排列整齐、清晰、细胞核较均匀，线粒体无破坏、无肿胀、无空泡化，未见自噬小体的形成。第3、7天之间无明显区别。假手术组：心肌组织结构基本完整，细胞形态大体正常，排列有序，可见清晰完整的细胞核。第3、7天之间无明显区别。模型组：第3天大鼠心肌纤维顺序排列不整齐，细胞结构断裂损害严重，细胞核表现不规则，线粒体出现肿胀、空泡化，细胞水肿加剧，变性明显，形成自噬泡；第7天心肌组织细胞紊乱，心肌纤维断裂，损害较严重，线粒体空泡化严重，结构模糊，自噬泡仍存在，与第3天相比，损伤程度略有下降。内关组：第3天大鼠心肌纤维排列略整齐，线粒体出现受损，少量细胞结构有损伤、空泡化，出现自噬小体；第7天心肌细胞受损不甚严重，少量线粒体被破坏，心肌细胞水肿不甚严重，与第3天相比，心肌间质和血管炎症浸润性损伤的程度得到明显减少。

A：空白组；B：模型组；C：内关组；D：假手术组

2.2 各组大鼠心肌组织Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表达各项比较 见表2。第3天时，空白组与假手术组各项比较，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组心肌组织Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表达高于假手术组，内关组Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA表达低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。第7天时，空白组与假手术组各项比较，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组心肌组织Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA表达均高于假手术组；内关组各指标mRNA表达低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组大鼠心肌组织Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表达比较

2.3 各组大鼠心肌组织Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达各项比较 见表3(图2、3)。第3天时，空白组与假手术组各项比较，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠心肌组织Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ蛋白表达水平高于假手术组，差异有统计学意义(均P<0.01)；内关组Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.01)。第7天，空白组与假手术组各项比较，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠的心肌组织Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)；内关组Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.01)。

表3 各组大鼠心肌组织Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 蛋白表达比较

A：空白组；B：模型组；C：内关组；D：假手术组

A：空白组；B：模型组；C：内关组；D：假手术组

3 讨 论

本实验依据中医“治未病”理论，采用电针内关穴预处理的实验方法探讨预防和治疗心肌缺血再灌注损伤，针灸预处理是传统中医学治未病的主要措施之一[12-13]。《灵枢》曰：“上工，刺其未生者也﹔其次，刺其未盛者也;其次，刺其已衰者也。”秉承了“未病先防，既病防变”的医学宗旨。大量文献研究表明，中药有效提取物和中医复方能抑制氧自由基形成，抑制炎症反应，继而保护受损心肌细胞，抵抗心肌缺血伤害。针灸预处理具有无创伤、绿色健康、见效快等优势，成为现代医学研究热门。古代医家治疗胸痹，选穴主要集中在特定穴，如五输穴、原穴、募穴、特定穴等，体现了循经取穴原则，其中手厥阴心包经为治疗胸痹选用频次最多的经脉[14]。内关穴是手厥阴心包经的络穴,通于阴维脉,对心胸疾病的治疗与预防有良好效果。本课题组前期研究表明，针灸预处理内关穴可以在48 h的延迟时相阶段，对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用[15-20]。同时，可增加内源性保护物质，并能诱导热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)家族中HSP27、HSP70 表达。在延迟时相阶段，针灸发挥的进一步保护心脏作用表明了针灸预处理具有心脏保护效应。

自噬是利用溶酶体这一细胞器来自我降解和循环利用细胞内物质成分的过程。自噬是真核细胞所专有的,并且主要负责长寿命蛋白、细胞器的降解及再利用，在维持细胞内环境稳态方面起着重要作用[21]。心肌缺血是指由于心脏血流灌注减少等所致的供氧不足、能量代谢紊乱等病理状态。自噬可以通过急性或慢性缺血被激活，再灌注过程将促使自噬体进一步形成。在应激情况下，自噬水平的高低将决定细胞的坏死或生存状况。因此自噬对细胞具有“双刃剑效应”。研究显示，酵母ATG6基因的同源物Beclin-1能与Ⅲ类磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class Ⅲ，PI3K)结合形成复合物，同时能够介导相关自噬蛋白在前自噬小体中的定位，调节自噬体的形成[22-23]。PI3K是哺乳动物参与调节自噬的特异性基因，其表达强度与自噬活性密切相关。因此,Beclin-1对自噬调节尤为重要。酵母自噬基因8(ATG8)在哺乳动物细胞中的同源基因为LC3，它存在于自噬体和溶酶体的膜上，自噬体以及溶酶体的数量可通过表达量的多少来反映。因此，LC3被视为自噬体的标志分子。本实验通过观察比较不同时间点上自噬基因Beclin-1和LC3的表达水平，反映自噬调控在不同时间点上的表达结果[24-25]。

本研究运用RT-PCR法、Western blotting法检测自噬表达相关基因Beclin-1、LC3蛋白在心肌细胞中的表达水平，从结果来看模型组Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I mRNA表达均高于空白组、假手术组。内关组Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I mRNA表达量低于模型组，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I蛋白表达水平也低于模型组。内关组自噬蛋白表达水平在第7天的表达量低于第3天，说明在心肌缺血发生过程中，心肌细胞会因缺血缺氧而激活自噬发生，并诱发细胞凋亡的出现。电针预处理内关穴可通过下调LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达来抑制自噬激活，防止心肌细胞凋亡发生，保护心肌组织。本研究分别检测了心肌缺血再灌注大鼠第3、7天心肌组织中自噬相关蛋白在不同时间点的表达水平，提示随着损伤时间延长，自噬在蛋白表达上出现进行性下调[26]。自噬在心肌缺血再灌注中可能发挥着双向调节作用，在不同治疗时间点的作用机制也不同。

综上所述,本实验证实了电针预处理内关穴，可调节MIRI自噬水平，而Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达下调，表明其信号通路可能参与了自噬的调控作用。此外，通过对比不同时间点的表达效果，第7天效果最佳。由于动物实验的局限性和本实验选择的时间点较少，检测指标也仅局限于Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平，对相关信号通路的研究内容过少。留针时间的长短和针刺频率的高低也是影响针灸效果的重要内容和关键因素。因此，针灸预处理的最佳时间点仍需进一步研究。