疫病净化中牛结核病的诊断方法及其应用

2022-12-12彭素晓

中兽医学杂志 2022年5期

彭素晓

（山东省临沂市罗庄区农业农村局 276017）

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的人与动物慢性细菌性传染病，我国将该病列为二类动物疾病，研究证实，发展中国家超过10%的人结核病都和牛分枝杆菌相关。根据我国兽医公报数据显示，2020年我国共发生115起牛结核病疫情，病例为761例，共扑杀261头患病牲畜。牛结核病具有宿主广泛和感染基数大的特点，且发病数量相对较少，由此影响了当地牛结核病防控和净化工作开展。

1 病原学特点

牛结核病引起的病菌类型主要为牛分枝杆菌和山羊分枝杆菌，其中牛分枝杆菌是一种严格需氧菌以及革兰氏阳性菌，该菌种长度为1.5～4 m、宽0.2～0.5 m，周身无鞭毛，不存在运动性，细胞壁含有大量类脂和腊脂，脂质含量约占总体重60%，耐干燥能力强、耐热性较差，在60℃环境下可存活30 min，80℃环境下5 min可以灭活，对一般的消毒剂存在较强抵抗力，且对紫外线酒精较为敏感[1]。

2 传播途径

2.1 呼吸道传播

牛结核病可在一年四季发生，并且宿主范围广泛，大约有50种哺乳动物以及25种禽类都能感染该病，奶牛是家畜中最容易感染的对象，黄牛、水牛次之，发病动物是主要的传染源，比如通过鼻液、唾液、痰液以及生殖道排出体外，然后经过呼吸道传播。牛以及野生动物吸入含有该病原菌的飞沫而受到感染。

2.2 消化道传播

牛结核病可以通过消化道传播，易感动物的饲料、饮水、草料受到感染后通常难以处理。在饲养管理良好并且通风条件好的情况下可以对牛结核病进行有效控制。研究发现结核病人饲养的病畜会导致牛结核病发生率较高，放牧饲养模式下牛结核病患病率仅为1%～5%，而散养模式下患病率升高到25%～50%。

由于致病菌的感染部位存在差异使得病例表现有所不同，主要包括肠结核、乳房结核、肺结核、淋巴结核以及神经结核。其中肺结核是牛结核病常见形式，发病后表现为呼吸困难、咳嗽、逐渐消瘦，而乳房性结核主要表现为泌乳量逐渐减少直到停止，同时乳汁稀薄，乳牛吸食后会受到感染。肠结核将造成肠道出现症状，多表现为便秘、腹泻。在毒瘤中最为常见淋巴结核，主要症状在于造成淋巴结肿大，而神经结核多表现为神经症状。

3 诊断方法

3.1 细菌学方法

利用细菌培养法涂片染色法及分枝杆菌生长指示管法可以对细菌学加以分析。涂片染色法主要应用荧光抗酸染色法以及萋尼染色对抗酸性杆菌进行检查，解剖之后在无菌条件下对病变组织器官进行采集，包括肝脏、淋巴结、肺脏，这种方法可以对抗酸杆菌检测，但是不能准确鉴定分枝杆菌和其它非典型分枝杆菌，约有40%～60%的病例难以检测。

细菌培养法是结核病诊断的金标准。由于牛分枝杆菌对养分需求高且生长缓慢，通常14～15 h分裂1次，整个过程经历4～8周，因此，标本采集及样品前处理过程中要求严格，临床分离成功率不高，以往主要采取罗氏培养基以及丙酮酸钠培养基等。传统固体培养基尽管制作便捷、价格低廉，然而培养时间偏长，罗氏培养基甘油含量如果高于0.75%会抑制刚分离的牛分枝杆菌，难以处理初代培养菌落。相比之下，丙酮酸钠培养基初代培养之后菌落主要为团型，便于操作BACTECMGIT960、7H9、BACTALERT3D等液体培养基含有较为复杂的营养成分，需要加入细菌抑制剂。相较于固体培养基，在培养时间污染率、阳性率等方面优势更加明显，不足在于检测成本偏高，牛分枝杆菌培养期间也存在着耗时长、阳性率低、污染率高等不足，因此不适宜推广[2]。

3.2 迟发型过敏反应试验

结核菌皮内变态反应为国贸指定的检测方法，早在1890年外国研究人员研制了结核菌素，并使用至今，依旧是牛结核病主要的检测方法，患病初期主要应用结核菌素点眼的方法加以诊断，根据牛眼充血程度判断结核阴性和阳性。不过该方法容易对牛产生刺激，后期开始应用皮试方法，相较于早期的检测方法优势明显，这是由于牛在感染初期细胞免疫水平，相比体液免疫反应更被容易检测。

皮试验法可以进一步分为尾褶结核菌素皮内检测、颈部单一结核菌素皮内试验、比较结核菌素皮内试验。研究发现，尾褶结核菌素皮内检测阳性率高于比较结核菌素皮内试验，而颈部单一结核菌素皮内试验阳性率低于比较结核菌素皮内试验，在环境中副结核分枝杆菌污染严重的地区通常使用皮试法加以检测。在基层地区更加容易推广，并且成本较低，不足之处在于特异性偏差感染之后的3～6周可能出现假阴性，并且和非结核分枝杆菌出现交叉反应，导致结果不准确。在实际操作中还要求间隔72 h才能进行皮厚测量，所以存在主观判断强、劳动强度大以及不适宜等问题，如果检测之后病情严重还可能出现假阴性结果。

3.3 γ-干扰素检测法

γ-干扰素试验在牛结核病检测中通常作为补充试验，在实际操作中需要先进行抗凝全血的采集，之后通过禽结核菌素、牛结核菌素平行刺激外周血淋巴细胞，然而受到免疫记忆的影响阳性牛将释放大量IFN-γ，产生的量与检测样本结核病菌素关系密切，因此可借助对比释放的IFN-γ含量确定。

当前我国已经研制γ-干扰素检测法国家标准，并将其视为牛结核病早期诊断方法。不过结核菌素皮内变态反应试验与γ-干扰素试验结果存在不一致情况。有研究发现一些个体IFN-γ方法结果为阳性，然而提示法结果显示阴性，利用提示法对阴性个体持续跟踪和监测，20个月发现86%个体逐渐具有阳性特点。IFN-γ检测方法主要优势在于当个体感染极低的情况下只需要外周淋巴细胞释放极少的IFN-γ，读取结果更加客观，不足之处在于操作复杂并且检测成本偏高，进行全血采集需要尽快运往实验室。然后刺激结核菌素，通常需要实验室人员具有足够的经验。研究还发现皮内变态反应试验之后8-28天再次进行IFN-γ检测灵敏度以及特异性差异不显著，IFN-γ检测实验可以和体内变态实验配合使用，由此实现平行试验以及系列试验。

3.4 ELISA抗体检测方法

ELISA抗体检测在牛结核病诊断中主要为辅助方法，也是目前唯一存在的血清学检测法。可以当做TST补充方法，由于牛分枝杆菌生长速度较慢，在感染不同阶段分泌一定量的蛋白质，主要用于血清学反应的抗原包括有CFP10、ESAT-6、LPSO、MPB70、MPB83、MPB164等，其中CFP-10和ESAT-6蛋白为早期分泌性抗原，单独使用之后异构性为100%，不过敏感性偏低，将二者蛋白混合使用可以保证高特异性显著提升敏感性，甚至可以超出PPD敏感性，还可以鉴别诊断自然感染的牛以及卡介苗免疫牛，借助MPB70可以对抗体进行检测，其作为牛结核病主要的体液免疫、细胞免疫靶抗原，在单独使用MPB70后，可以得到ELISA方法，并且让特异性达到98%，将敏感性控制在21%左右。并且将MPB83、MPB70和ESAT-6抗原融合形成的MA-ELISA方法特异性同样显著，达到了96%，且敏感性达到69.4%，这一结果明显高于MPB70、MPB83和ESAT-6单独表达，证实了多抗体联合应用可以让血清学诊断的敏感性大大提升。

感染晚期牛体内带有高循环抗体，会受到细胞免疫受到抑制，出现假阴性TST，所以主要应用ELISA抗体检测方法。在ELISA抗体检测研究中鹿抗体反应被较早的发现，研究证实ELISA检测敏感性较高，可以作为野生动物辅助检测方法。牛分枝杆菌感染动物的体内存在变态反应叠加，在2～8周皮内变态反应期间ELISA检测效果更好。整体来看，ELISA方法可以作为TST皮试的补充方法，也可以作为“无反应性个体”替代方法，进而发现与淘汰阳性牛，使得牛群处于健康的状态下。

3.5 分子生物学检测方法

在我国分子生物学技术不断发展的今天，PCR、荧光定量、核酸探针陆续被用于牛结核病病原学诊断，其中IS6110是结核分枝杆菌的多拷贝的保守片段进行了引物扩增靶序列，凭借良好的特异性和灵敏性，在人结核病PCR检测中得到了广泛的利用。而插入序列IS1081在人型和牛型分枝杆菌中有5～6个拷贝，并且在其他分枝杆菌尚未发现该序列，所以可以基于IS6110和IS1081等结核杆菌插入序列进行扩增靶点PCR检测，这在牛结核病诊断中具有重要意义，有一项检测牛结核菌recA-IS6110-IS1081的PCR检测方法，证实敏感性较高，可作为牛分枝杆菌以及结核分枝杆菌快速检测的工具。

4 检测方法在牛结核净化根除中的应用

4.1 常用检测方法实际应用对比

TST和和IFN-γ检测法主要用于早期诊断牛结核病，而ELISA血清检测法主要用于病情后期以及感染严重的阶段，使用效果明显。通常皮内变态要求牛结核菌素注射量2000IU单位，不过牛结核病净化与根除过程中OLE推荐剂量为5000IU单位，并且要求注射剂量控制在0.2 ml之内，尽管当前规定了皮内变态反应标准的操作方法，不过对菌合素抗原标准没有统一。

对比SICT和SICCT两种检测方式发现，SICT有着更强的敏感性，适合在结核病流行地区加以检测，SICCT控制稳定地区的净化工作更加有效，通过ELISA和TST对比试验，跟踪检测TST检测呈阴性的牛，之后通过组织病理学以及PCR方法加以验证发现阴性当中83.7%都被牛分枝杆菌感染，可以作为TST的补充试验。将TST试验作为标准对比IFN-γ、ELISA、SICTT在污染场所中的检测结果发现IFN-γ方法的阳性检出率要比SICTT更好，并且ELISA敏感性比TST实验显著下降，结核病阴性病率偏高的牧场可以联合使用SICT、IFN-γ提升阳性检测率。当前没有商品试剂盒，可以通过牛潜伏感染以及活动性结核病加以鉴别诊断。

4.2 发达国家牛结核病主要防控和监测方法

成功控制及根除牛结核病的发达国家普遍严格执行检疫扑杀相结核病的防控措施，并完善的监测体系，从立法层面来保证净化工作的开展，在净化成功试验过程中提示法作用明显，其中爱尔兰研究人员单一使用皮试法对全体牛群进行监测，再如美国、澳大利亚、加拿大以及诸多欧洲国家通过皮试法与IFN-γ联合使用，澳大利亚同样在早期根除牛结核病监测过程中使用了皮试法，后期引入哈哈方法进行联合试验。不仅能够提升阳性检测效果，同时也保证了阴性牛健康程度应用TST进行检测，并在高风险地区应用平行试验，由此检测出高敏感性，增加阳性油的检测效果，而低风险地区利用系列试验由此提高特异性，避免出现错杀情况，也有部分地区将和TST结核病应用，如韩国后期开始用IFN-γ和ELISA抗体结核病的方法根除结核病，英国、美国、新西兰部分野生动物体内存在宿主，导致牛结核病根除存在很大难度。新时期，澳大利亚、德国，荷兰等国家已得到欧盟吴杰和认可，再如美国、日本、法国普遍实现了牛结核病的控制，不过当前还没有相关国家通过OLE无结核病并认可。

4.3 防控措施

预防控制牛结核的主要原则为监测、检疫、扑杀、消毒相结合，坚持因地制宜、逐步净化、分类指导的工作流程，开展养殖区域净化工作。当前在牛结核病防控方面尚未研制出有效的疫苗，无法进行药物治疗，在牛结核病净化群当中检测出阳性牛主要是及时扑杀和基层的检测手段，主要利用SICT和SICCT，部分有条件的实验室利用IFN-γ方法加以检测。新时期，我国开始创建布鲁氏杆菌以及结核病净化厂与示范县，以养殖场为单位极大地推动了牛结核病的净化进程。