院内制剂夏膝颗粒中迷迭香酸含量的HPLC测定

陈 珍，成光宇，位鸿，何蕊，陈 颖*

（1长春中医药大学，长春 130117；2长春中医药大学附属医院，长春 130021）

夏膝颗粒处方为首届国家名中医黄永生教授的临床经验方，用于治疗眩晕之痰瘀互结证型的高血压，于临床上取得良好的疗效，将其开发成院内制剂—夏膝颗粒，本制剂由夏枯草、牛膝、茺蔚子、决明子等八味药组成，夏枯草为本方中的君药，现代药理学实验证明夏枯草具有良好的降压作用[1]，其中迷迭香酸是夏枯草中的有效成分[2-3]。本试验以夏枯草中迷迭香酸对照品作为对照，研究并建立了HPLC迷迭香酸的含量测定方法，可以作为夏膝颗粒质量控制的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津LC-2030C）；紫外检测器（LC solution色谱数据工作站）；色谱柱（岛津Inertsil，规格：4.6 mm×250 mm，5 μm）；超声波清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）； CP225D型电子天平（德国sartorius公司）。1.1.2药品与试剂 迷迭香酸对照品（批号：111871-202007，规格：每支20 mg，采购于中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其它试剂均为分析纯。供试样品：夏膝颗粒（批号：20220101、20220102、20220103）。

1.2 色谱条件与系统适应性

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1%三氟乙酸（40:60）；检测波长330 nm；流速1.0 mL·min-1。进样量5 µL；迷迭香酸的理论塔板数不低于6 000[4]；柱温为25 ℃。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品迷迭香酸10.06 mg，置10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，得浓度为1.006 mg·mL-1的溶液；再精密吸取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为0.1006 mg·mL-1的对照品溶液[4]。

1.4 供试品溶液的制备

取本品粉末（过四号筛）约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，超声处理（功率240 W，频率50 kHz） 30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[4]。

2 方法学验证

2.1 专属性考察

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 mL，注入液相色谱仪，色谱图见图1、2、3。

图1 迷迭香酸对照品高效液相色谱图

图2 供试品溶液高效液相色谱图

图3 阴性对照溶液高效液相色谱图

可见在此条件下，迷迭香酸峰与其它峰分离较好，阴性对照无干扰。

2.2 线性关系考察

分别精密吸取迷迭香酸对照品溶液1 mL，2 mL，5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，注入液相色谱仪，测定，以进样量（mg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

回归方程：Y = 2 799 488.530 8 X-3 981.079 0，r = 1.000 0 ，迷迭香酸线性范围为0.050 3 mg～1.006 0 mg。结果见图4。

图4 迷迭香酸标准曲线

2.3 耐用性考察

2.3.1 流速的考察 选择0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.2 mL·min-1的流速进行试验，含量测定结果：RSD为0.51%，说明流速对测定结果影响不大。结果见表1。

表1 流速考察结果

2.3.2 柱温考察选择25℃，30℃，35℃，依法测定，考察柱温对分离效果的影响，测定结果：迷迭香酸的RSD为5.58%（见表2）。其中25℃，30℃条件下迷迭香酸RSD为1.60%，但25℃条件下供试品的峰是融合峰，基线未完全分离；30℃，35℃条件下迷迭香酸RSD为7.40%，说明柱温对含量测定结果影响较大，柱温要控制在30℃。

表2 不同柱温考察结果（25℃，30℃，35℃）

2.3.3 不同色谱柱的考察选取不同品牌的色谱柱考察其对试验结果的影响，RSD为0.19%，说明不同色谱柱对其测定结果影响不大。结果见表3。

表3 不同色谱柱考察结果

综上所述，通过对流速、柱温、不同流动相比例和不同品牌色谱柱的考察试验，发现流速和不同品牌色谱柱的变动测定结果影响较小，柱温和不同流动相比例对测定结果影响较大，在试验中需要控制。

2.4 稳定性考察

精密吸取对照品溶液和同一供试品溶液各5 mL，分别在0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，24 h依法测定，以迷迭香酸峰面积积分值为指标。结果见表4。

表4 稳定性考察结果

结果：对照品溶液的RSD为0.50%，供试品溶液的RSD为0.52%，24 h内稳定性良好。

2.5 精密度考察

精密吸取对照品溶液和同一供试品溶液各5 mL，注入液相色谱仪，连续进样6次。结果见表5。

表5 精密度考察结果

精密度考察结果显示：对照品溶液的RSD为0.21%，供试品溶液的RSD为0.10%，方法、仪器的精密度良好。

2.6 重现性考察

精密称取同一批样品6份，照1.4供试品溶液项下制备方法制备，依法独立测定。结果见表6。

表6 重现性考察结果

考察结果：RSD为1.92%，平均含量为0.330 7 mg·g-1，此方法的重现性良好。

2.7 准确度试验

供试品的制备：取重复性试验同批样品2 g，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加0.704 2 mg·mL-1的迷迭香酸溶液1 mL，加入稀乙醇49 mL，超声处理30 min，放冷，称定其重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。共制成6份样品，依法测定，计算回收率。结果见表7。

表7 回收率试验结果

测定结果：RSD为1.47%，平均回收率为97.72%，本法准确性较好，方法可行。

2.8 含量测定

取三批中试样品，依法制备供试品溶液，依法测定。结果见表8。

表8 三批中试含量测定结果 mg·g-1

故暂定：本品每袋颗粒含夏枯草以迷迭香酸（C23H28O11）计，不得少于2.40 mg。

本品三批中试样品含量测定的平均结果为0.341 0 mg·g-1，本品规格为每袋装10 g，含量限度按测定结果平均值的80%计算：制剂中迷迭香酸含量×每袋装量×80% = 0.341 0 mg·g-1×10 g/袋×80% = 2.727 9 mg/袋。但投料时，每批夏枯草药材的含量有高有低，也可以按中国药典规定的夏枯草药材的含量和提取转移率计算，根据正交试验的验证性试验结果，迷迭香酸的平均转移率70.53%（按验证的转移率计算），按《中国药典》夏枯草项下“含迷迭香酸（C23H28O11）不得少于0.30%”的规定[4]，标准处方中，夏枯草220.0 g，制成1 000 g，本品规格为每袋装10 g，含量限度按测定结果平均值的80%计算，本品每袋颗粒含夏枯草以迷迭香酸的计，计算公式：夏枯草药材量×夏枯草药典含量×平均转移率×每袋装量×80%÷标准处方量= 220 g×0.20%×70.53%×10 g/袋×80%÷1 000 g = 2.48 mg/袋

3 结论

药典以甲醇-0.1%三氟乙酸（42:58）为流动相，在此条件下，供试品色谱中迷迭香酸色谱峰与相邻f峰分离欠佳，将流动相比例调整为甲醇-0.1%三氟乙酸（40:60），迷迭香酸色谱峰分离良好。

本试验以夏枯草中迷迭香酸对照品为对照，进行了方法学考察并建立了含量测定的方法，暂定：本品每袋颗粒，含夏枯草以迷迭香酸（C23H28O11）计，不得少于2.40 mg。