止痛消结散对小鼠肿瘤细胞与DRG神经元共培养模型TRPV1表达的影响

郭玉玉，胡佳佳，郁沙莎，翟笑枫

（中国人民解放军海军军医大学第一附属医院中医肿瘤科，上海 200083）

癌痛（癌性疼痛）特指由肿瘤直接浸润神经根、神经干、神经丛或者神经，累及空腔及实质器官，诱发局部坏死、炎症等，引起疼痛，常伴有牵涉痛，对恶性肿瘤患者的生活和生存质量产生了严重的影响，为目前发生率最高和最难耐受的临床症状之一，同时也是治疗恶性肿瘤的重要组成部分。目前，世界卫生组织已经将癌痛全面纳入癌症综合规划治疗内容之中[1]。

背根神经节（DRG）神经元是靠近椎间孔内侧的脊髓背根肿胀结节，接收来自身体受体的所有神经冲动，包括疼痛。目前的研究[2]表明，与疼痛传递密切相关的膜通道辣椒素受体1，也称为TRPV1受体（TRPV1），是一种对Ca+具有高度亲和力的非选择性阳离子通道，它在多感觉伤害感受器中表达，并介导多种急性和持续性疼痛，如外周和中枢神经系统炎性疼痛和癌症疼痛，在调节疼痛方面发挥重要作用。有文献[3]证明，Lewis肺癌细胞晚期骨转移后，感觉神经纤维上TRPV1受体被局部酸性肿瘤微环境激活，进而诱导骨骼感觉神经产生，导致骨痛的发生。基于此，本研究通过实验建立肿瘤细胞与DRG神经元共培养模型以及药物干预模型，探讨止痛消结散的止痛作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

小鼠背根神经节神经元细胞、A549细胞，购自无锡菩禾生物医药技术有限公司。

1.2 药物及主要试剂

止痛消结散，上海雷允上药业有限公司。Trizol（invitrogen）；DEPC处理水（购自Sigma）；氯仿/异丙醇/无水乙醇（购自上海国药）；SYBRGreen PCR试剂盒（型号Thermo F-415XL）；逆转录试剂盒（型号Thermo K1622）。

1.3 主要仪器

低温冷冻离心机（型号Sigma 3K15）；Realtime检测仪（型号ABI-7500）；光学显微镜（型号XDS-1A）；电泳仪（购自BIO-RAD 公司，型号mini protean 3 cell）；电转仪（PS-9，大连竞迈科技有限公司）；酶标仪（型号ThermoMK3）；一体式化学发光成像仪（型号ChemiScope 5300 Pro）。

1.4 止痛消结散浸提液制备

称取1 g止痛消结散粉末于50 mL离心管，加入15 mL DF12基础培养基，置于水浴锅37 ℃溶解5 h，取上清，用过滤器过滤待用。

1.5 肿瘤细胞与DRG神经元细胞共培养模型建立及分组

1）制备神经元细胞悬液：消化收集神经元细胞，调整神经元细胞浓度至106/mL，6孔板中接种106/孔；2）肿瘤细胞共培养：制备A549细胞悬液，调整细胞浓度为106/mL，在神经元细胞培养孔中加入0.4 μm的transwell小室，上室接种肿瘤细胞2×105/孔；3）止痛消结散处理：共培养模型更换新鲜含1/10止痛消结散浸提液的完全培养基，下室2 mL，上室500 μL，培养24 h或48 h后收集细胞或上清液进行各指标检测。实验分组：1）A组，DRG神经元；2）B组，肿瘤细胞+DRG神经元组（24 h）（DRG下室，肿瘤细胞上室）；3）C组，肿瘤细胞+DRG神经元组（48 h）；4）D组，肿瘤细胞+DRG神经元组+止痛消结散（24 h）；5）E组，肿瘤细胞+DRG神经元组+止痛消结散（48 h）。

1.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测上清液中IL-6的表达情况

共培养模型更换新鲜含1/10止痛消结散浸提液的完全培养基，下室2 mL，上室500 μL，培养24 h或48 h后收集48孔板各组上清液至无菌离心管中，标记组，取出6孔板中的原培养基，用PBS清洗1次；加入1 mL胰蛋白酶消化至大部分细胞变圆，加入完整培养基终止消化，以1 200 rpm离心3 min收集细胞；用PBS清洗2次。检测收集的细胞上清液中IL-6的含量，检测步骤按照试剂盒说明书进行。

1.7 Western Blot法检测共培养体系相关蛋白表达情况

加入PMSF的预冷Ripa裂解液至样品中，充分裂解12 000 g，离心10 min，取上清液，定量蛋白质并将其储存在-80℃冰箱中。蛋白质样品电泳和膜转移；BSA在室温下封闭1 h或4℃过夜。一抗在4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min。二级抗体与膜在37 ℃孵育1 h，用TBST洗涤3次，每次5 min。在胶片上加入适量的ECL发光溶液，用集成化学发光仪拍照。

1.8 实时定量法检测共培养体系相关基因的表达情况

收集细胞，用3 mL PBS洗涤细胞2次，弃上清液；加入1 mL Trizol试剂，给予充分均质，室温下静置5 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈摇动15 s，静置3 min；4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，取上清液；加入0.5 mL异丙醇，充分混合，在冰上放置20～30 min；4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液；添加1 mL 75%乙醇并清洗沉淀物。在4℃下离心7 500 g，持续5 min，并弃上清液；在超净台中吹干约5 min，并添加适量的无核糖核酸酶H2O溶解。提取的RNA反转录成cDNA，并用RT-PCR检测。

1.9 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。测量数据以平均值±标准差（±s ）表示。单因素方差分析用于多组之间的比较。2组间采用最小显著性差异法（LSD法）进行比较。以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 止痛消结散浸提液对IL-6表达的影响

见表1。

表1 止痛消结散浸提液对IL-6含量的影响（±s，n = 6）

表1 止痛消结散浸提液对IL-6含量的影响（±s，n = 6）

注：与A组比较，## P＜0.01；与B组比较，△△P＜0.01；与C组比较，▲▲P＜0.01；与D组比较，□□P＜0.01

组别 含量 /（pg·mL-1）A组 0.000±0.000 B组126.671±9.521##C 组157.899±7.486##△△D 组 65.454±2.900##△△▲▲E 组 32.336±1.825##△△▲▲□□

2.2 止痛消结散浸提液对TRPV1蛋白表达的影响

与A组相比，与肿瘤细胞共培养24 h和48 h后，目的蛋白TRPV1的表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；而在共培养体系中（24 h和48 h）分别加入止痛消结散处理后，目的蛋白TRPV1表达水平相比共培养组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，止痛消结散浸提液能降低DRG神经元细胞中TRPV1蛋白表达水平。见图1。

图1 止痛消结散浸提液对DRG神经元细胞中TRPV1蛋白表达水平的影响

2.3 止痛消结散浸提液对I L-6 R、Trpv1mRNA表达的影响

Trpv1和IL-6R的变化情况类似，即相比A组，肿瘤细胞与DRG神经元共培养组（24 h，48 h），两者表达水平显著增加，其中共培养48 h比24 h显著，差异有统计学意义（P＜0.01）；加入止痛消结散处理后，两者表达水平显著降低，其中共培养48 h下降程度比共培养24 h显著，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，止痛消结散浸提液能降低DRG神经元细胞中IL-6R、Trpv1 mRNA表达水平。结果见图2。

图2 止痛消结散浸提液对DRG神经元细胞中IL-6R、TRPV1 mRNA表达水平的影响

3 讨论

目前，WHO提出的“癌痛三阶梯”规范治疗方案在临床上应用较广泛，绝大部分患者可有效缓解，但止痛药使用后不良反应较多，易增加成瘾性，反复使用易造成中枢神经系统发生适应性变化，对患者的身心健康和社会功能产生了巨大影响[4]。

祖国医学通过应用辨证论治的理论，对癌痛病人进行辨证施治，提高了止痛药的效果，并且安全性高，毒副作用较少，不存在成瘾性和耐药性，配合“癌痛三阶梯”治疗方案可以有效的增效减毒和增强止痛效果[5-6]。其中，中医外治法联合其他止痛治疗方式治疗癌痛疗效确切、作用迅速、毒副作用小，治疗过程安全，有效的提高了癌痛患者的生活质量、延长了患者的生存周期。

现代医学普遍认为，癌痛的病理产生机制可能与中枢敏化、外周敏化、肿瘤对外周神经的直接作用和骨溶解等因素有关。肿瘤细胞与肿瘤组织周围存在着大量的不同类型的炎性细胞，例如：中性粒细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和T淋巴细胞，这些炎性细胞可以分泌不同类型的炎性介质，包括表皮生长因子、内皮素-1、转化生长因子-α、缓激肽、白介素-1、白介素-6、肿瘤坏死因子-α、前列腺素等，这些不同类型的炎性介质通过其各自的受体直接或间接作用于初级传入神经元，从而产生疼痛[7]。

在对止痛消结散中药物的作用进行文献分析后，发现方中的血竭具有抗炎、镇痛的作用，其主要构成物质中的剑叶龙血素A和剑叶龙血素B等可以有效降低TRPV1的活性[8]。复方血竭可抑制UC大鼠白细胞介素-1β、白细胞介素-6的表达，上调白细胞介素-4和白细胞介素-10的表达，并且可以调节免疫功能异常，从而促进消除炎症和修复组织[9]。乳香的主要成分乳香酸通过抑制白三烯的合成以及减少5-脂氧合酶的活性从而进一步发挥抗炎作用[10]。没药的主要成分为没药油，它能减少IL-6的合成，有效的预防牙周炎和龈炎相关性炎症，其机理是能减少成纤维细胞释放的致炎因子，故常常用于牙龈炎和牙周炎的治疗[11]。IL-6是已知参与几种炎症和神经性痛觉过敏的促炎细胞因子[12-14]。在骨癌痛的大鼠模型中，脊髓中IL-6mRNA水平增加[15]。IL-6通过IL-6R的典型信号传导或通过IL-6R的反式信号传导对靶细胞发挥调控作用[16]。

本研究观察到，在肿瘤细胞与DRG神经元细胞共培养模型中加入止痛消结散浸提液后， IL-6表达水平明显降低，时间越长，IL-6表达下降越明显，表明止痛消结散浸提液能够抑制IL-6的表达。同时，在共培养体系中加入止痛消结散浸提液处理后，目的蛋白TRPV1表达水平显著降低，表明止痛消结散浸提液能降低DRG神经元细胞中TRPV1蛋白表达水平。因此，止痛消结散能有效的缓解肿瘤患者的癌性疼痛，其作用机制可能与下调DRG神经元中TRPV1表达水平有关。