辣椒八氢番茄红素合成酶鉴定、进化与表达分析

郑佳秋， 梅 燚， 吴永成， 王薇薇， 张丽娜， 张永吉， 陈以博， 祖艳侠， 万红建

(1.江苏沿海地区农业科学研究所，江苏盐城 224002； 2.浙江省农业科学院，浙江杭州 310021；3.江苏里下河地区农业科学研究所，江苏扬州 225007)

辣椒(CapsicumannuumL.)原产于中南美洲热带亚热带地区，富含维生素C和辣椒素，营养价值丰富，在我国有着悠久的栽培历史，年种植面积约200万hm2，在我国蔬菜周年供应中起重要作用。辣椒成熟果实颜色主要由果实中类胡萝卜素组分及其相对含量决定。类胡萝卜素是光吸收复合体的重要组成成分，主要分布在植物有色体和叶绿体膜中，在保护光合作用器官、防止光氧化损伤等方面发挥了重要作用[1-2]。类胡萝卜素合成需经过缩合、脱氢、环化等一系列反应[3]，而八氢番茄红素合成酶(PSY)既是类胡萝卜素合成途径的首要限速酶，又是控制碳源流向的首要关键酶，分别诱导PSY基因组成型和功能型特异表达，可显著提高植物非绿色组织中的类胡萝卜素含量，PSY基因已成为植物类胡萝卜素基因工程改良主要目的基因[4-7]。

鉴定和分析辣椒果实中的PSY(CaPSY)基因对揭示其在辣椒类胡萝卜素合成及果色形成中的作用具有重要理论意义。前人研究认为，成熟时辣椒果实的颜色由3对独立的基因y、c1、c2控制[8]。Lefebvre等研究发现，辣椒红素/辣椒玉红素合成酶基因(Ccs)控制红色果实和黄色果实的遗传差异，与前人研究命名的y基因相对应，定位在6号染色体上[9-10]。而Thorup等认为，八氢番茄红素合成酶基因(PSY)调控红色与橙色果实的遗传差异[11-12]，该基因与前人研究认为的c2位点相对应，调控果实中类胡萝卜素的含量。Tian等应用病毒诱导沉默辣椒红素生物合成途径上的4个关键基因(Psy、Lcyb、Crtz、Ccs)以研究辣椒果实颜色的形成，发现单独沉默和同时沉默几个关键基因时，基因表达水平均降低，辣椒红素合成减少，果实呈现黄色或橙色[13]，这与前人研究认为的红色是显性由位于6号染色体y位点的单独基因控制的观点[14]不一致。进一步研究发现，当沉默PSY基因时，β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质、辣椒红素含量显著减少，表明沉默PSY基因负面影响了辣椒红素生物合成途径的中间产物，从而引发辣椒红素含量的降低，表现出正常果实与沉默果实颜色的明显不同，可见PSY基因在辣椒果实颜色形成过程中的重要作用。

目前，PSY基因在草莓、甜橙、小麦等植物上已有相关研究，而辣椒PSY基因家族的鉴定和生物信息学分析方面报道较少。本研究对辣椒及其他植物PSY基因进行鉴定分析系统发育关系，对鉴定出的辣椒PSY基因家族成员进行生理和结构分析，并荧光定量分析组织表达特异性，有助于了解辣椒PSY基因的功能和结构特征，为进一步探索辣椒果色形成的分子机制提供一些理论依据，为创制不同果色新种质资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 CaPSY基因家族的鉴定

利用植物PSY基因隐马尔科夫(HMM)模型对辣椒2个全基因组数据库PGP(http：//peppergenome.snu.ac.kr/)和Pepper Genome Database 2.0(http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index/jsp)进行搜索，获得辣椒PSY基因相关信息，通过Pfam(http：//pfam.janelia.org/)进行鉴定。其他植物的八氢番茄红素合成酶基因信息来源于Phytozome数据库(https：//phytozome.jgi.doe.gov/)。

1.2 CaPSY基因家族的系统发生学和染色体定位分析

利用pI/Mw工具(http：//web.expasy.org/compute_pi/)计算等电点和分子量。外显子-内含子结构模式图由Gene Structure Display Server(GSDS)绘制。通过ClustalX软件对获得的CaPSY基因进行氨基酸序列比对，再用MEGA 11.0软件采用邻接(Neighbor-Joining，NJ)法，校验参数Bootstrap设为1 000次重复，构建系统进化树。利用MEME (http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi) 分析保守基序。用DNAMAN 6.0软件分析序列间的相似性。结合辣椒基因组数据库中获得的辣椒PSY基因位置信息，利用MapDraw 2.1进行染色体定位，在线(http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)分析这些基因的串联重复和片段重复特征。

1.3 试验材料与方法

辣椒品种为Y28，种子由江苏沿海地区农业科学研究所蔬菜花卉研究室提供，2016年种植于江苏省盐城市南洋试验场。辣椒种子先用55 ℃温水处理20 min后，放在28 ℃水中浸泡 6 h，取出种子用湿纱布包好，28 ℃黑暗光照培养箱中进行催芽，每天用自来水冲洗1次，大约4 d种子露白，播于穴盘中育苗，放在塑料大棚中进行生长，培养条件：昼温为20～25 ℃，夜温为10～15 ℃。当幼苗长至4叶1心时，取根、茎、叶组织，液氮取样后在-80 ℃超低温冰箱中存放备用。辣椒幼苗长至 8～10张真叶时移栽到露地，3个月后果实成熟时，取花、嫩果(花后15 d)、成熟青果(花后30 d)、转色期果实(花后40 d)、成熟红果(花后50 d)作为样品，液氮取样后在-80 ℃超低温冰箱中存放备用。

采用RNASEOUT RECOMB.RNASE INHIB提取试剂盒(Invitrogen公司)，参考说明书分别提取根、茎、叶、花、嫰果、成熟青果、转色期果实、成熟红果的总RNA。参照SUPERSCRIPT Ⅲ TRANSCRIPT试剂盒(Invitrogen公司)说明书合成cDNA。CaPSY基因特异引物用Prime 5软件设计，以UBI作为内参检测基因。

1.4 CaPSY基因家族的表达特性分析

采用实时定量PCR检测CaPSY基因组织特异性表达，反应体系为20 μL，包括10 μL 2× SYBR premix ExTaqTM，1 μL cDNA(稀释10倍)，0.4 μL上游引物(10 μmol/L)，0.4 μL下游引物(10 μmol/L)，8.2 μL ddH2O。PCR程序为二步法：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃复性30 s，循环40次。采用2-ΔΔCT法计算基因表达量[15]。

2 结果与分析

2.1 CaPSY基因的鉴定

利用植物PSY基因HMM模型对辣椒2个全基因组数据进行搜索，通过Pfam网站进行鉴定，最终获得6个CaPSY基因(表1)。CaPSY基因编码的蛋白为303～432个氨基酸，其中CaPSY04编码的蛋白最长有432个氨基酸，CaPSY03编码的蛋白最短有303个氨基酸。相对分子量为33.61(CaPSY03)～48.44 ku(CaPSY04)。除CaPSY06基因编码的蛋白等电点是5.59，为酸性蛋白，其余的等电点均大于7，为碱性蛋白。

2.2 CaPSY基因的结构分析

为了解CaPSY基因结构进化情况，将PSY基因的核苷酸序列与相应的基因组序列校正后确定内含子/外显子的结构图(图1)。结果表明，CaPSY基因中除了CaPSY03基因没有内含子，其他基因内含子的数量为5～12个。CaPSY02的内含子最多，有12个，其次是CaPSY06，有9个内含子，CaPSY04和CaPSY05均含有5个内含子，有相似的内含子/外显子结构模式。

2.3 CaPSY基因的序列分析

为了明确CaPSY基因的序列特征，采用Clustal X和DNAMAN 6.0软件对辣椒6个CaPSY基因的氨基酸序列进行多重序列比对。研究结果表明，所有的辣椒CaPSY基因都含有1个保守的反式-异平基-二磷酸合成酶结构域，存在4个保守的天冬氨酸残基(图2)，比Marchler-Bauer等的研究[16]多了2个天冬氨酸富集区，与前人的研究结果趋于一致。根据氨基酸序列相似性比对结果(表2)可知，CaPSY01、CaPSY04和CaPSY05基因的氨基酸序列相似性最高，其中CaPSY01与CaPSY04的相似性为59.7%，CaPSY01与CaPSY05的相似性为60.1%，而CaPSY04与CaPSY05的相似性高达85.3%，其次CaPSY02与CaPSY06的相似性为68.6%，CaPSY03与其他5个PSY基因的氨基酸相似性仅为8.1%～16.5%。

表2 CaPSY基因的氨基酸序列相似性

2.4 CaPSY基因家族的系统发育和保守基序分析

Tran等认为，部分藻类还保留PSYⅠ和PSYⅡ 2个家族，但高等植物只有PSYⅠ家族[17]。利用MEGA 11.0软件中的邻接法构建进化树，Bootstrap设为1 000次重复，去掉Bootstrap支持率低于60%的节点。结果表明，植物PSY氨基酸分成重要的2类：CladeⅠ和CladeⅡ，基本与PSY分类学上的结论[18-20]相符，同时也表明PSY的同源性与物种的亲缘关系相关，如茄科的辣椒、马铃薯、茄子和番茄PSY聚在一起，藻类的团藻和微胞藻聚在一起，说明进化发生比较近。水稻、高粱和二穗短柄草聚在一起，表明PSY旁系同源基因的分化早于禾本科植物的种属演化[21]，而且与其作用部位功能分化相关[22]。同个植物不同PSY之间的亲缘关系有相近的，如CladeⅠ中辣椒CaPSY01、CaPSY04、CaPSY05聚为一支(CladeⅠa)，表明他们具有较高的保守性，其中CaPSY04和CaPSY05聚在一起，说明亲缘关系较近，CaPSY02和CaPSY06聚为一支(CladeⅠb)，说明它们进化发生比较近。也有亲缘关系较远的，如辣椒CaPSY03单独聚在CladeⅡ中最外围，与其他辣椒PSY亲缘关系较远，可能也预示着基因不同的功能(图3)。

为了研究辣椒CaPSY基因之间结构的多样性，利用MEME在线工具对鉴定的6个CaPSY基因序列进行保守基序鉴定，结果见图4。在辣椒中鉴定到8个保守基序，长度依次为41、50、50、41、40、50、50、50(表3)。CaPSY01、CaPSY04和CaPSY05编码的蛋白均含有相同的5个保守基序(motif1+motif2+motif3+motif4+motif5)，CaPSY04和CaPSY05在进化分析中遗传距离较近，并且它们编码的蛋白保守基序分布也很相似，说明这2个基因亲缘关系较近。CaPSY02编码的蛋白含有5个保守基序(motif1+motif2+motif6+motif7+motif8)，CaPSY06编码的蛋白含有3个保守基序(motif6+motif7+motif8)，基序motif6、motif7和motif8是CaPSY02和CaPSY06编码的蛋白特有的基序，CaPSY03编码的蛋白仅含有1个motif2保守基序，与其他CaPSY基因的进化关系较远，这与进化分析的结果相一致。

表3 辣椒CaPSY基因的保守基序

2.5 CaPSY基因家族的染色体定位

根据鉴定得到的PSY基因的染色体位置信息进行染色体定位，如图5所示，6个CaPSY基因分布在辣椒12条染色体中的4条染色体上，其中CaPSY01、CaPSY02和CaPSY03位于1号染色体上，CaPSY04、CaPSY05、CaPSY06分别位于2号、4号和10号染色体。在线(http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)分析CaPSY基因的重复特征，未发现串联重复情况。

2.6 CaPSY基因家族的表达特性分析

已有研究表明，在黄龙胆中至少有2 个PSY基因，PSYⅠ基因在花中特异性表达[23]，苹果中有4个PSY基因，并且在不同的时期和组织中它们的表达量也不同[24]。为了更好地了解辣椒中6个CaPSY基因的特性，笔者研究了CaPSY在辣椒不同组织器官(根、茎、叶、花、嫩果、成熟青果、转色果、成熟红果)中的表达模式。设计了特异引物，在保守区域的外围通过RT-PCR进行扩增。CaPSY基因特异引物由Prime 5软件设计，以UBI作为内参检测基因(表4)。如图6所示，6个CaPSY基因在辣椒根、茎、叶、花和果实组织器官中均有表达，说明基因为组成型表达，但表达量存在差异，整体表现为花中表达水平最高，其次是果实，根部和茎部的表达量比果实中低，而叶中表达量最低，其中叶片和茎部器官中起主要调控作用的是CaPSY04和CaPSY05；根中以CaPSY03和CaPSY04为主参与根部类胡萝卜素的合成；花器官中除了CaPSY06表达量低以外，其余CaPSY基因表达量都很高；CaPSY03和CaPSY05在果实中随着果实成熟度的增加表达量逐渐增加，在果实转色期和红果中的表达量最丰富，这与草莓的相关报道[25]相一致，推测辣椒红果中类胡萝卜素的合成主要由CaPSY03和CaPSY05这2个基因调控，而CaPSY04和CaPSY06则表现出差异，表达量开始随果实成熟度的增加而增加，但果实完全转化成红果时表达量却降低，推测主要在果实转色期起调控作用。

表4 辣椒CaPSY基因扩增引物序列

3 讨论与结论

许多研究表明，辣椒成熟果实颜色的差异主要是由于类胡萝卜素成分的变化，在植物体中已鉴定出许多酶和基因与类胡萝卜素的合成相关[26]，其中PSY被认为是首要的调控基因[27]，已有研究表明通过沉默PSY基因表达发现其与橙色果实相关[13]。本研究基于已知的2个辣椒全基因组数据库鉴定出的6个CaPSY基因，相较于其他作物如番茄、木薯、玉米中鉴定的3个PSY基因而言，辣椒CaPSY基因编码的相对数量较高。

辣椒CaPSY编码蛋白属于全反式-异平基-二磷酸合成酶超家族(Trans_IPPS)，它包括4个天冬氨酸富集区域，比Marchler-Bauer等的研究结果[16]多了2个天冬氨酸富集区域，整体相一致。6个CaPSY基因定位在辣椒的4条染色体上，未发现串联重复情况。系统进化树分析结果表明，PSY的同源性与物种的亲缘关系相关，6个辣椒CaPSY基因与茄科中的其他辣椒、番茄、马铃薯和茄子聚合度较高，但同一植物的不同PSY基因之间也会表现出亲缘关系的远近，如本研究中辣椒6个CaPSY聚为2类，其中CaPSY04和CaPSY05的亲缘关系最近，CaPSY03与其他CaPSY的系统进化关系最远，与基因的保守基序分析和氨基酸序列相似性分析结果相一致，预示着家族中每个基因具有不同的功能。

研究基因在组织和器官中的特定表达可以更准确地了解其在组织中的功能作用[28-29]。本研究鉴定出的6个辣椒CaPSY基因在根、茎、叶、花和果实中均有表达，说明基因为组成型表达，但表达量存在差异，呈现出组织特异性的功能分化，这与已报道的草莓PSY表达模式[25]相似，其中CaPSY03、CaPSY04和CaPSY05基因是辣椒各组织器官中调控类胡萝卜素的主要基因，在成熟红果中CaPSY03和CaPSY05的表达量最高，推测辣椒红果中类胡萝卜素的合成主要由这2个基因调控，这为研究新的分子靶标创制辣椒不同果色资源提供了理论依据。本研究探讨的辣椒CaPSY基因家族的特性，为CaPSY基因功能机制的研究提供了基础。