瓦松总多酚提取工艺及其抗氧化研究

赵 楠，张春楠，李宛泽，张 越，李 旭

(牡丹江师范学院 生命科学与技术学院, 黑龙江 牡丹江 157011)

中草药饲料添加剂因其高效低毒且无抗药性等优点受到广泛关注[1]。多酚可作为饲料添加剂，在改善禽畜肠道菌群方面具有重要作用[2-3]，随着对绿色产品的需求越来越强烈，植物多酚作为天然抗氧化剂得到人们的青睐[4-5]。瓦松为景天科瓦松属多年生草本植物，一年生莲座丛的叶短;莲座叶线形,先端增大，为白色软骨质，半圆形；有齿。在我国分布广泛，因常生长于瓦片之上而得名。研究发现，瓦松含有黄酮类、甾醇类、萜类、多酚等多种化学成分[6-8]，在提高宿主抗氧化、抗病毒、抑菌[9-10]以及增强免疫调节等生物活性方面显示良好的应用潜力[11-13]。对瓦松有效成分的提取多集中于其多糖[14]、黄酮[15]和三萜[16-17]类成分的研究，鲜少有学者对瓦松内多酚类物质进行提取研究。因此，本文综合考虑瓦松中其他类成分的研究方法，在单因素考察的基础上，结合正交试验，研究最佳多酚提取工艺条件，评价其抗氧化能力，进一步为瓦松在饲料添加剂中的应用可行性提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

中药瓦松购于亳州市康美中药城，经鉴定为景天科瓦松属植物瓦松(Orostachysfimbriatus)，粉碎后过60目筛，备用。中药精细粉碎机、宁波新芝SB-5200DT(360W)超声波清洗仪，721型紫外分光光度计，电子天平。没食子酸对照品，纯度大于98%，购于合肥博美生物有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法1.2.1 没食子酸标准曲线

依据参考文献[18]，采用福林酚比色法绘制标准曲线。精密称量10.0 mg没食子酸，蒸馏水溶解后，转移至50 mL棕色容量瓶中定容后摇匀，获得没食子酸对照品溶液，置于低温处储藏备用。取7个10 mL容量瓶标记为1～7号，按标记向容量瓶中依次精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL对照品溶液，加入0.5 mL福林酚溶液，混匀后静置一段时间，再滴加2 mL 20%碳酸钠溶液，蒸馏水定容后于室温下静置1 h后，于760 nm处测定溶液的吸光值A。以吸光度值(A)对没食子酸的浓度(c)进行线性回归，其回归方程为A=34.823c+0.013 3，线性相关系数R2=0.999 0，表明其在0.000 2～0.003 2 g/L浓度范围内具有较好的线性关系。

1.2.2 瓦松总多酚的提取和测定

准确称取1.0 g瓦松样品粉末，按照料液比加入定量乙醇溶液，在适宜温度下进行超声提取，将得到的提取液于室温下冷却后过滤，得到的上清液即为样品提取液。量取1 mL上清液依次加入福林酚试剂、碳酸钠溶液，操作方法与“1.2.1”项下相同。根据线性回归方程，计算瓦松提取液中的总多酚含量，并按照公式(1)计算提取率。

(1)

式中：C为样品提取液的质量浓度，g/L；V为瓦松总多酚溶液的体积，mL；m为瓦松样品质量，g。

1.2.3 单因素试验

以瓦松总多酚提取率为考察指标，测定不同乙醇浓度对总多酚提取率影响，设定条件为10倍量不同浓度乙醇溶液，分别采用40%、50%、60%、70%、80%浓度乙醇溶液，采用超声装置于70 ℃下提取70 min；测定不同提取温度对总多酚提取率的影响，设定提取条件为10倍量50%乙醇溶液，分别在40、50、60、70和80 ℃温度下超声提取70 min；测定提取时间对总多酚提取率的影响，设定提取条件为10倍量50%乙醇溶液，70 ℃下分别提取40、50、60、70和80 min；测定料液比对总多酚提取率的影响，设定提取条件为一定体积的50%乙醇溶液，70 ℃下超声提取70 min，其中料液比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40 g/mL。

1.2.4 正交试验

根据单因素试验结果，对瓦松总多酚提取工艺进行四因素三水平正交试验优化其参数。以检测瓦松总多酚提取率为指标，以乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、料液比(D)作为影响因素，进行L9(34)正交试验设计，正交因素水平如表1。

表1 正交试验因素水平

1.2.5 抗氧化实验

根据文献[19]方法，选取不同浓度瓦松总多酚溶液1 mL置于10 mL具塞试管中，再加入水杨酸溶液(10 mmol/L)和硫酸亚铁溶液(9 mmol/L)各1 mL，混匀后加入1 mL过氧化氢溶液(8.8 mmol/L)，振荡使之充分混匀后于37 ℃水浴下反应30 min，并于波长510 nm处测定混合溶液的吸光度值A1，空白对照采用蒸馏水代替样品溶液进行测定得吸光度值A0，吸光度值A2为用蒸馏水代替双氧水溶液测得，抗坏血酸为阳性对照，根据公式(2)计算瓦松总多酚对羟基自由基的清除率。

(2)

1.3 数据统计及分析

单因素试验和抗氧化实验数据通过Origin 9.0进行分析，正交设计试验结果通过SPSS 22.0软件进行分析。

2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1.1 乙醇浓度的影响

作为提取中药有效成分的常见溶剂，乙醇的浓度往往会对该中药目标有效成分提取率产生一定的影响。由图1可知，瓦松的多酚提取率随着乙醇浓度的提升出现先升高后下降的趋势，当乙醇浓度达到50%时，多酚提取率达到峰值，后继续提高乙醇浓度，瓦松总多酚的提取率反而下降。瓦松中多酚的极性较大，乙醇浓度过高，溶剂极性偏小，不利于多酚成分的提取，故选择乙醇浓度为50%进行考察。

图1 乙醇浓度对多酚提取率的影响

2.1.2 提取温度的影响

根据图2可知，当温度较低时，在一定范围内瓦松总多酚提取率较低，随着温度逐渐升高，其内的分子运动速度加快，增加了多酚在溶液中的溶解度，因而其提取率随温度的升高而增加。但当温度超过70 ℃时，多酚结构的稳定性降低，破坏其分子结构，故提取温度设定在70 ℃进行考察。

图2 提取温度对多酚提取率的影响

2.1.3 提取时间的影响

在提取过程中，有效成分的溶解与扩散需要一定的时间，当扩散达到平衡时提取完成，长时间的提取容易导致成分降解以及杂质溶出增加。由图3可知，在瓦松总多酚提取过程中，提取时间从40 min增加到70 min时，提取率随时间递增后达到峰值，并在继续延长提取时间后检测到提取率明显下降。因此为保证在得到最大提取量的前提下，选用70 min的提取时间为最适方案。

图3 提取时间对多酚提取率的影响

2.1.4 料液比的影响

多酚受料液比因素影响下提取率变化结果见图4，在料液比为1∶10 g/mL时多酚的提取率最大，随着溶剂用量的增加，提取率反而呈下降趋势，溶剂量过大导致其他成分溶出增加，降低了瓦松总多酚的提取率。因此选择提取时料液比为1∶10 g/mL进行考察。

图4 料液比对多酚提取率的影响

2.2 正交试验2.2.1 正交试验结果及分析

以单因素试验结果为基础，对瓦松总多酚提取率进行正交试验，确定其最佳提取工艺。正交试验结果如表2所示。由表2分析可知，各因素对瓦松总多酚提取率的影响由大到小依次为提取时间(C)>提取温度(B)>料液比(D)>乙醇浓度(A)，根据k值分析，其最优组合为A1B1C2D2，即10倍量的40%乙醇溶液，60 ℃下超声提取70 min。由表3分析可知，提取温度、提取时间和料液比对瓦松总多酚提取率影响显著(<0.05)，而乙醇浓度对瓦松总多酚提取率影响不显著(>0.05)。

表2 正交试验结果分析

表3 方差结果分析

2.2.2 验证试验

为验证正交设计优化后的工艺是否可靠，对提取条件A1B1C2D2进行验证，即10倍的40%乙醇溶液作为提取溶剂，60 ℃下超声提取70 min，进行3组平行试验，得到总多酚提取率分别为13.98%、13.73%和14.16%，其平均值为13.96%，相对标准偏差为1.55%。该结果表示经由正交试验设计优化后的工艺条件稳定，具有一定的科学性。

2.3 抗氧化实验结果

由图5可知，在浓度0.2～2.0 g/L范围内，瓦松总多酚对羟基自由基清除率随浓度的增加显著增长，呈现显著的正相关，其半数清除浓度(IC50)为0.886 g/L。该结果表明瓦松总多酚对羟基自由基有一定的清除能力，具有一定体外抗氧化活性。

图5 瓦松总多酚体外抗氧化能力

3 讨论

通过超声辅助乙醇提取法结合单因素及正交试验，对影响瓦松总多酚提取率的多个因素进行考察并优化工艺，最终确定其最佳提取工艺条件为乙醇浓度40%，提取温度60 ℃，提取时间70 min，料液比1∶10 g/mL，在此条件下瓦松总多酚提取率达到13.96%，其中提取时间对提取率的影响最大。在抗氧化实验中，瓦松总多酚对羟基自由基的清除能力与其浓度呈现明显的正相关，其IC50值为0.886 g/L，该结果表明瓦松总多酚具有良好的抗氧化能力。

超声辅助提取法[20]是中草药有效成分常有的提取方法之一，该方法既对提取物质没有要求也不会影响提取物质的活性和结构，同时还具有操作简单、易分离等特点，在对中草药有效成分的提取中广泛应用，能够大大节省试验所需要的时间。对瓦松总多酚的提取工艺研究中，应用超声辅助乙醇提取法，优化后的工艺方案中不仅可以节约溶剂，而且适当的温度进行提取不会破坏有效成分的结构。

羟基自由基清除实验结果表明，瓦松总多酚具有较好的抗氧化活性，其清除自由基能力与浓度呈明显的正相关。随着促生长类饲料添加剂的全面退出，提高免疫类中药饲料添加剂[21]应用的越来越广泛，本文通过对瓦松总多酚的提取与抗氧化的研究，以期为瓦松作为饲料添加剂提供一定的参考价值。

4 结论

该研究为超声辅助乙醇法从瓦松中提取总多酚，通过单因素和正交试验优化，得到总多酚的最佳提取工艺为60 ℃下10倍量40%乙醇溶液超声提取。在此条件下，瓦松总多酚提取率为13.96%。同时对从瓦松中提取的总多酚进行抗氧化活性研究，多酚对羟基自由基的清除能力与其浓度呈明显正相关，其半数清除浓度为(IC50)为0.886 mg/mL，呈现出良好的抗氧化性。