猕猴源大肠杆菌药敏试验与高致病性毒力岛基因的检测

韩冬梅，陈柄汛，赵维薇，万 全，邓 静，王 喜，张 博，吕龙宝，肖 鹏，高 洪

(1.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201；2. 中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650201 ；3. 云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；4. 云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

猕猴(Macacamulatta)又称“恒河猴”，具有与人类相似的生理生化和代谢特征，大脑发达，适应性强，容易驯养繁殖，因此猕猴被广泛应用于生物学和医学研究。高质量实验动物有利于科研工作的顺利进行，但是在猕猴的饲养繁育过程中发现其腹泻发病率较高，不利于养猴业持续高质量发展[1]。引起猕猴腹泻的原因有很多，其中大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)是温血动物肠道中广泛存在的共生细菌，在一定条件下也是引起肠道疾病的常见病原体[2]。E.coli大量存在于人和动物中，一旦产生致病性E.coli对于养殖场是致命打击，并且有些饲养管理者会使用抗菌药对猴群进行集体治疗和预防，这导致E.coli耐药菌株增加，大大提高了饲养成本。

高致病性毒力岛(High pathogenicity island,HPI)最初于耶尔森菌中发现，是耶尔森菌中1个35～45 kb 的基因组，携带的基因与铁载体耶尔森杆菌素合成、调节和转运有关[3]。具有毒力岛的基本特征：(1)载有耶尔森菌素与毒力相关的编码基因； (2)仅存在于强毒株； (3)G+C mol%与耶尔森菌染色体有明显差异； (4)染色体片段一般大于35 kb； (5)为一紧密、明确的遗传学单位； (6)一侧外缘与酰胺-转运核糖核酸(Asparagine-transfer ribonucleic acid,asn-tRNA)基因相连; (7)载有“可移动”的基因[4-5]。HPI主要含有与摄取铁有关的毒力基因簇，编码参与摄取及合成铁载体耶尔森杆菌素的铁抑制蛋白基因及其调节基因，来行使“铁的摄取功能”[6]。其中铁调节蛋白2(Iron regulatory protein 2, irp2)基因为铁调节基因并且核苷酸序列具有高度保守性[7]，是HPI的标志基因[8]。大量的研究表明，HPI能介导细菌的致病性，HPI+菌株致病性强于HPI-菌株[9-10]。大量文献证明，HPI可以通过噬菌体介导的水平转移存在于不同肠道菌(如大肠埃希菌、构株酸杆菌、克雷伯菌和沙门菌等)[11-13]和不同种属中，严重影响着我国养殖业的健康发展，使养殖场经济效益变差。因此，不可忽略E.coliHPI+对猕猴养殖业的影响。本试验通过对采集的23份腹泻猕猴粪便进行E.coli分离鉴定、HPI全基因组携带情况检测、纸片扩散法检测和动物回归试验，探索HPI基因携带率与耐药性和致病率之间的关系，为研究E.coli引起猕猴腹泻的致病机理提供科学依据，并为昆明动物研究所灵长类实验动物饲养繁殖基地的饲养管理和疾病预防提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 于2020年10月在中国科学院昆明动物研究所灵长类实验动物饲养繁殖基地采集了23只腹泻猕猴的粪便，离心管收集，冰袋保存运输。

1.1.2 主要试剂 2×TaqPCR Master Mix,购自北京百泰克生物有限公司；DL2 000 DNA Marker,购自博迈生物科技有限公司；麦康凯琼脂培养基、LB(Luria-Bertani)琼脂和LB肉汤，均购自广东环凯微生物科技有限公司；细菌微量生化反应管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；标准革兰染色液，购自南京森贝伽生物科技有限公司。实验小鼠品种为昆明小鼠，雌性，体重约为30 g，购自昆明医科大学[生产许可证号:SCXK(滇)K2020—0004]。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 将采集的腹泻猕猴源粪便样品分别用5 mL生理盐水稀释，用无菌挑菌环挑取稀释后的粪便样品在麦康凯培养基平板上划线，放入37 ℃恒温培养箱隔夜培养。待第2天早上用挑菌环挑取麦康凯平板上的粉红色单菌落在LB平板上划线,放入37 ℃恒温培养箱培养后取单菌落接种于LB液体培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养，至OD600值达0.6～0.8，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 细菌革兰染色及生化鉴定 取LB平板上的单菌落，根据革兰染色液说明书的方法分别进行涂片固定、初染、水洗、媒染、脱色、复染6个步骤，最后在油镜下观察细菌形态特征。E.coli生化鉴定按照说明书的方法取LB液体纯培养物分别接种于麦芽糖、乳糖、蛋白胨、硫化氢、甘露醇、尿素、葡萄糖共7个微量生化鉴定管。

1.2.3 分离菌株HPI基因检测 在 NCBI 网站 GenBank 中检索E.coliHPI 中 12 个基因的序列，通过 BLAST 得到各基因编码区(Coding sequence,CDS)的保守区，使用 Primer 5.0 软件设计引物，引物由硕擎生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

取纯化菌液进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL：模板1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，去离子水7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火(退火温度见表1)30 s，72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物以 2%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，最后在凝胶成像系统中观察并拍照。

1.2.4 药敏试验 采用世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的纸片法(Kirby-Baure)将分离纯化的E.coli菌液稀释至0.5麦氏单位，取 200 μL菌液均匀致密地涂布在LB琼脂培养基上，取阿米卡星、多黏菌素、氯霉素、环丙沙星、头孢哌酮、头孢噻肟、苯唑西林、四环素、头孢唑林、头孢曲松等药敏片均匀贴到培养基表面，为防止药敏纸片掉落先平置放入37 ℃恒温培养箱1 h后，再倒置培养18～24 h观察药敏结果。按美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)标准进行药敏试验结果判断。

1.2.5 致病性试验 取12只健康的小鼠随机分为3个组：HPI阳性(HPI+)组、HPI阴性(HPI-)组和空白组，每组4只。将筛选出的携带HPI全基因组的E.coli感染猪小肠上皮细胞，观察出现致细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)最明显的菌株选定为HPI+菌株，从HPI基因携带率为0的E.coli菌株中随机选出1株作为HPI-菌。随后将HPI+和HPI-菌液都稀释至0.5个麦氏单位，分别腹腔注射0.5 mL菌液于对应分组的小鼠，空白组腹腔注射0.5 mL LB液体培养基。3个组小鼠分别饲养并观察，记录各组小鼠临床表现及死亡情况，剖检死亡小鼠，取肠道组织分离细菌并鉴定。

1.2.6E.coliHPI全基因组测序 将筛选出携带HPI全基因组的E.coli感染猪小肠上皮细胞，观察出现CPE最明显的2株菌株(H-7和H-23)培养至对数期，委托北京擎科生物科技有限公司进行全基因组测序。为了更加直观地了解基因在正、反义链上的分布情况、基因组序列信息、基因组序列的GC含量等，构建H-7、H-23菌株基因组圈图并进行基因功能注释，包括蛋白相邻类的聚簇(Clusters of Orthologous Groups,COG)、基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,KEGG)。

2 结果

2.1 细菌分离与鉴定 本试验从23份腹泻样品中成功分离获得23株分离菌，分离率为 100%。分离菌株在麦康凯培养基上为桃红色的单菌落(图1A)，在LB平板上为突起、光滑、圆形的单菌落(图1B)，革兰染色呈红色短杆状，成对或单个出现(图1C)。

图1 细菌分离结果

将分离菌株接种于细菌微量生化管,鉴定结果如表2所示，分离菌均能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蛋白胨，产酸产气，硫化氢试验和尿素试验结果均为阴性，符合E.coli特性。

表2 菌株生化鉴定结果

2.2 分离菌株HPI基因检测E.coliHPI 12个全岛基因检测的凝胶电泳成像结果见图2，HPI基因携带情况为23株E.coli中21株含HPI基因，携带率为91.30%，其中共11株E.coli检测出含irp2基因，阳性率为47.83%；15株E.coli检测出含irp1基因，阳性率为65.22%；8株E.coli检测出含irp3基因，阳性率为34.78%；11株E.coli检测出含irp4基因，阳性率为47.83%，16株E.coli检测出含irp5基因，阳性率为69.57%；13株E.coli检测出含irp6基因，阳性率为56.62%；10株E.coli检测出含irp7基因，阳性率为43.48%；9株E.coli检测出含irp8基因，阳性率为39.13%；10株E.coli检测出含irp9基因，阳性率为43.48%；8株E.coli检测出含fyuA基因，阳性率为34.78%，这8株菌株同时也检出全部含irp2基因，阳性率为100%；15株E.coli检测出含intB基因，阳性率为65.22%;6株E.coli检测出含ybtA基因，阳性率为26.09%。该批样品ybtA基因携带率最低，为26.09%，irp5基因携带率最高，为69.57%，其中携带HPI全岛基因的E.coli共有5株，占样品总量的21.74%。

图2 HPI基因的PCR扩增

2.3 药敏试验 5株携带HPI全岛基因的E.coli对试验药物多数呈耐药状态，对头孢类药物中头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松和头孢唑林具有耐药性的分别有4、4、4株和5株；对氯霉素、阿米卡星、环丙沙星、苯唑西林和四环素具有耐药性的分别有1、3、3、5株和5株；这5株E.coliHPI+对多黏菌素的耐药性都处于中介(表3)。5株携带HPI全岛的E.coli都表现为多重耐药，全部耐3种以上抗菌药。

表3 5株携带HPI全岛基因大肠杆菌分离株的药敏试验结果

2.4 致病性试验 小鼠感染细菌后12 h的存活情况如图3所示，HPI+组小鼠感染HPI+菌株在8 h内全部死亡，占100%，而HPI-组感染HPI-菌株的小鼠在12 h内有1只小鼠死亡，占25%，空白组小鼠始终保持正常。死亡小鼠被毛粗乱无光泽，肛门附近沾有粪便，剖检小鼠发现肝淤血呈黑褐色，胃膨大，内含黄白色物体，小肠菲薄，肠内充满气体和淡黄色稀薄内容物，黏膜充血呈淡红色(图4)。取HPI+组死亡的小鼠肠道进行组织涂板后，分离获得的菌株与攻毒菌一样，均为E.coli，且从HPI+组死亡小鼠中分离出的E.coli携带HPI的阳性率为100%。

图3 小鼠存活情况

图4 小鼠剖检结果

2.5 菌株H-7和H-23基因组圈图和基因功能注释

2.5.1 菌株H-7和H-23基因组圈图 通过 Prokka(1.13)软件对菌株H-7和H-23的高通量测序结果进行分析，H-7预 测 到5 300个编码基因，其总长4 728 917 bp，平均长度892 bp。非编码核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)预测中，核糖体核糖核酸(Ribosomal ribonucleic acid,rRNA)有24个、转运核糖核酸(Transfer ribonucleic acid，tRNA)有96个、转运-信使核糖核酸(Transfer-messenger ribonucleic acid,tmRNA)有1个、其他核糖核酸(Miscellaneous ribonucleic acid,misRNA)有236个；H-23预测到5 460个编码基因，其总长4 811 637 bp，平均长度881 bp。非编码RNA预测中，rRNA有24个、tRNA有89个、tmRNA有1个、miscRNA有212个。利用预测得到的基因组信息用Circlize绘制H-7、H-23基因组圈图(图5)，H-7基因组全长5 273 592 bp，G+C mol%为50.45%；H-23基因组全长5 415 449 bp，G+C mol%为50.32%。菌株H-7和H-23的基因圈图由外到内第1圈为基因组序列信息；第2圈为基因组序列的GC含量曲线，可见该菌株在全基因组平均GC含量线中上下波动频繁，但波动幅度不大；第3圈为基因组序列的GC skew曲线以2 000 bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均GC含量；虚线展示了GC skew为0的参考线；第4圈为二代测序深度及覆盖度信息以2 000 bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均测序深度，反应出不同区域的Reads覆盖情况；虚线展示了整体水平的平均Reads覆盖度；第5圈为三代测序深度及覆盖度信息以2 000 bp为一滑窗在基因组上滑动，统计的平均测序深度，反应出不同区域的Reads覆盖情况；虚线展示了整体水平的平均Reads覆盖度；第6圈展示了参考基因组中的基因编码区(CDS)以及非编码RNA区(rRNA、tRNA)，以内外两层表示，外层代表正链，内层代表负链。

图5 H-7(A)和H-23(B)基因组圈图

2.5.2 菌株H-7和H-23的COG 注释 将H-7、H-23菌株预测得到的基因序列与 COG功能数据库做 BLAST+(2.9.0+)比对，得到的基因功能注释结果如图6所示，H-7和H-23分离株基因通过COG分析，分别得到2 870个和2 782个基因信息分到22类COG中，主要与碳水化合物转运和代谢(G)、氨基酸转运和代谢(E)、能量生产和转化(C)有关。

图6 H-7(A)和H-23(B) COG 结果分类

2.5.3 菌株H-7和H-23的GO注释 将H-7和H-23分离株基因组数据通过GO数据库注释结果，如图7所示，分别共有7 563个和7 651个基因，分为生物学过程、细胞成分和分子功能三大类，大部分基因富集在细胞成分。

图7 H-7(A)和H-23(B)GO注释结果分类

2.5.4 菌株H-7和H-23的KEGG 注释 使用KEGG数据库对H-7菌株的2 818个基因和H-23菌株的2 846个基因进行注释，并将基因分为五大类，主要分布为细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢和生物系统。其大部分基因主要富集在碳代谢过程，如图8所示。

图8 H-7(A)和H-23(B) KEGG pathway结果分类

3 讨论

猕猴作为我国使用最广泛的实验动物，我国共有6个亚种，分别为海南亚种、指名亚种、川西亚种、西藏亚种、福建亚种和河北亚种，均为国家二级保护动物[14]。实验动物的健康问题影响着试验结果的可靠性，而猕猴腹泻在灵长类动物饲养基地是较为常见的一种疾病，发病后会使猕猴营养不良、繁殖率降低，甚至会导致仔猴死亡[15]，严重危害灵长类动物的饲养管理，不利于高质量实验动物的产出，应该引起高度重视。本试验采集的23份腹泻猕猴粪便，经革兰染色、生化鉴定分离得到23株E.coli，分离率为100%。在23株E.coli中HPI各基因携带率由高到低为irp5(69.57%)>irp1(65.22%)=intB(65.22%)>irp6(56.62%)>irp2(47.83%)=irp4(47.83%)>irp7(43.48%)=irp9(43.48%)>irp8(39.13%)>irp3(34.78%)=fyuA(34.78%)>ybtA(26.09%),说明HPI各基因携带率具有差异。其中fyuA携带率比irp2低，可能是由于fyuA处于毒力岛功能核心区的边缘,HIP的不稳定性使其在不断进化的过程中,更易于被破坏和改变[16]。本试验结果显示从猕猴腹泻粪便中分离出来的E.coli存在HPI，耶尔森菌素 (Yersiniabactin,Ybt)铁载体介导的铁获取是HPI的主要功能，E.coli中存在HPI可增强E.coli的环境适应力和感染力。其次，虽然E.coli中存在多种铁获取系统，但Ybt铁载体对Fe3+具有较高的亲和力，有研究表明铁载体不仅在铁运输中起作用，还可能抑制宿主免疫应答[17-18]。HPI不仅是猪源、禽源、兔源等常见动物E.coli的重要毒力因子[19-20]，还存在于日常生活不常见的动物中。如史秋梅等[21]报道在腹泻水貂源性E.coli中检测出HPI基因irp2和fyuA；高平光等[22]报道在腹泻的6只狐狸中有4只狐狸的E.coli检测出含有HPI基因irp2和fyuA;徐继英等[23]报道在奶牛源E.coli也检测出含HPI基因irp2和fyuA;宋晓莉等[24]通过对10份腹泻羔羊源粪便进行增菌培养,制备DNA模板,并用PCR方法进行检测，结果发现其中携带HPI的E.coli占样品的一半，表明HPI已经通过质粒水平转移[25]，在不同种属间广泛存在，严重危害公共安全，其潜在的流行病学意义不容忽视。本试验成功分离出的猕猴源致病性E.coliHPI+菌株为耶尔森菌HPI在不同种属间水平转移提供了重要依据。本试验分离携带HPI全基因组的5株E.coli对10种常用兽用抗菌药的耐药率都较高，其中5株E.coliHPI+分离株对苯唑西林、四环素和头孢唑林均能产生耐药性，只有对氯霉素和多黏菌素耐药性较低，故在猕猴饲养管理实际生产中可以联合使用氯霉素和多黏菌素进行治疗。在致病性试验中小鼠腹部注射E.coliHPI+菌后在8 h内4只全部死亡，而接种E.coliHPI-菌的小鼠在12 h内仅死亡1只。说明含HPI强毒力岛会增强E.coli的致病性。本试验通过高通量测序获得了H-7、H-23基因组图谱、GO、COG和KEGG注释，通过GO、COG、KEGG注释进一步清楚了解E.coliHPI+菌株中编码基因的作用方式、特征以及所参与的代谢通路，为E.coliHPI+分子致病机制研究提供了初步线索。

综上所述，23份猕猴源性腹泻样品中分离鉴定得到23株E.coli，分离率为100%，其中携带HPI基因有21株，占91.30%，携带HPI全岛菌株有5株，占21.74%。HPI通过水平转移存在于不同源性的E.coli中，严重威胁公共卫生安全,后续可以深入研究猕猴源E.coliHPI+菌株的致病机理，为预防猕猴腹泻病提供科学依据。药敏试验说明携带HPI全岛基因的E.coli耐药性极高，提示可以进一步研究高耐药性是否与携带HPI有关。通过高通量测序获得了基因组图谱、GO、COG和KEGG注释，得到了大量的生物学信息，可为更好地了解E.coliHPI的发病机制提供参考。