基于16S rRNA测序对2型糖尿病患者肠道菌群特征的分析

何 倩，杨 建，陈冰婷，谭惠文，伊丽则热·艾拜杜拉，马晓丽

(1新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830017，2新疆医科大学附属中医医院药学部，乌鲁木齐 830002，3新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室，乌鲁木齐 830000)

我国2型糖尿病的患病率达11.2%，持续的高血糖会导致患者代谢紊乱并加重脏器负担引发一系列并发症，已成为影响公共健康的慢性疾病之一[1-3]。研究表明2型糖尿病的发生不仅与患者饮食结构有关，还与肠道菌群的变化密不可分，肠道菌群结构的稳定对机体新陈代谢平衡具有十分重要的意义，目前对肠道菌群的研究已成为防治2型糖尿病世界研究热点[4]。肠道微生物群通常被称为容纳数万亿微生物的隐藏器官，由500～1 000种细菌和1 014个细菌组成，作为机体最庞大、最重要的微生态系统[5]，其结构和多样性的改变与一系列代谢性疾病有关。肠道菌群的失调会通过代谢、炎症、免疫等途径诱导包括肥胖和糖尿病在内的一系列代谢性疾病的发生[6]。Larsen 等[7]在2010年研究了2型糖尿病患者(T2DM)和对照组肠道菌群的差异变化，通过PCR技术采用实时定量 qPCR法检测了36名成年男性的粪便细菌组成，通过16 S rRNA 基因 V4区标记编码进行扩增子焦磷酸测序分析鉴定菌种，结果表明2型糖尿病患者的肠道菌群与正常相比结构以及组成发生了改变，包括有益菌群的丰度减少，有害菌群的丰度增加。因此，改变2型糖尿病患者的肠道菌群结构，使紊乱肠菌数目和组成转归是治疗2型糖尿病的方法之一。新疆特殊的气候条件使得当地居民长期暴露于高脂肪、高热量的饮食环境下，有学者[8]采用16 srDNA实时荧光定量(q-PCR)技术对新疆不同人群2型糖尿病人群肠道菌群结构特征进行了深入的分析，证实了肠道菌群在不同饮食环境下对糖尿病人群存在显著差异。本研究采用16 srRNA测序的方法，分析比较2型糖尿病患者与正常人群肠道菌群结构、丰度及多样性的差异，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究所用30例粪便样本来自新疆医科大学附属中医医院2015年1月-2018年12月在和田地区、塔城地区、库车县的流行病学调查。随机抽取15名2型糖尿病志愿者为研究组，另选取15名正常志愿者为对照组，本研究经新疆医科大学附属中医医院伦理委员会通过，研究对象均签署知情同意书。

1.2 T2DM诊断标准采用国际通用T2DM诊断标准：患者空腹血糖值大于7 mmol/L，或者餐后血糖值和随机血糖值大于11.1 mmol/L即可诊断为T2DM。

1.3 纳入标准符合T2DM诊断标准并被确证为糖尿病患者，对照组纳入标准：40～80周岁，既往病历及本次体检中肠道疾病筛查阴性，同时没有任何疾病记录。

1.4 排除标准排除患有感染性疾病、胃肠道疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、血液系统和心血管系统疾病以及神经精神疾病者，并且试验前3个月内未服用过益生菌、抗生素等药物。

1.5 粪便样本的采集及DNA提取采用无菌勺收集各组新鲜粪便5 g，放入无菌保存管，置于-80℃冰箱中存放待检。采用Magnetic Soil And Stool DNA Kit 试剂盒(中国TIANGEN 公司，批号DP180427)按说明书操作提取粪便样品 DNA。

1.6 粪便样品DNA的PCR扩增及高通量测序对粪便样品菌群16SrRNA V3-V4区进行PCR扩增，以稀释后的基因组DNA作为模板，每个样品会加带有barcode的引物，针对细菌16SrRNA V3-V4高可变区进行扩增。扩增条件:在98℃初始变性1 min，然后在98℃变性10 s，在50℃退火30 s，在72℃延伸30 s。最后72℃保温5 min。使用TruSeq® PCR-Free DNA建库试剂盒进行文库构建，再经过Q-PCR和Qubit进行定量和文库检测，达标后采用NovaSeq 6 000上机测序。

2 结果

2.1 肠道菌群的测序结果与OUT聚类通过对30个粪便样品菌群样本的测序，共导出3 126 393条原始数据，经拼接、质控、嵌合体过滤，得到 1 950 264条有效数据。在 97% 相似度下，所有样品通过有效序列聚类通过物种分类导出 OTU共有1 565个，其中两组共有的OTU 为767个，研究组和对照组特有的分别为715个和83个。

2.2 肠道菌群物种多样性分析研究组与对照组的Alpha多样性指数对比，差异无统计学意义(P>0.05，Wilcoxon RankSum Test)。本实验中检测各组样本覆盖率均大于 0.99，表明样本中的序列被检出的概率极高，见表1。图1显示，Stress=0.054，研究组和对照组分布在不同区域，表明健康人群与糖尿病患者的肠道菌群结构存在一定差异。同时，与对照组相比，研究组的Unweighted Unifrac距离显著降低(P<0.05)，表明两组间物种Beta多样性存在显著差异，见图2。

表1 糖尿病和正常人肠道菌群Alpha多样性指数

图1 研究组和对照组的无度量多维标定(NMDS)分析图图2 研究组和对照组基于Unweighted Unifrac Beta多样性的箱形图

2.3 对照组与研究组菌群组成及差异研究组和对照组中肠道菌群的优势菌群大都属于厚壁菌门和拟杆菌门，见图3。研究组中优势菌属相对丰度从高到低依次排列是：拟杆菌属(Bacteroides)19.3%、肠球菌(Enterococcus)7.6%、克雷伯氏菌属(Klebsiella)7.0%、普拉梭菌属(Faecalibacterium)6.9%、大肠杆菌志贺菌(Escherichiashigella)5.3%、狄氏副拟杆菌属(Parabacteroides)2.4%、普雷沃氏菌属(Prevotella)1.9%、艾克曼菌属(Akkermansia)0.9%。与对照组相比，研究组中的克雷伯氏菌属(Klebsiella)的相对丰度显著升高，而狄氏副拟杆菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、艾克曼菌属(Akkermansia)的相对丰度显著降低，见图4。

图3 研究组和对照组门水平核心菌群

图4 研究组和对照组属水平核心菌

2.4 研究组和对照组肠道菌群差异性分析图5显示通过LefSe分析得出两组在2纲2目4科5属3种的相对丰度有显著差异。在属水平上，对照组的生物标志物包括：双歧杆菌属、艾克曼菌属、普雷沃氏菌属、狄氏副拟杆菌属，研究组的生物标志物为克雷伯氏菌属。

图5 研究组和对照组LDA分布柱状图

2.5 研究组和对照组Tax4Fun功能预测分析选取每个样本或分组在各注释层级上最大丰度排名前10的功能信息见图6，相对丰度前7的KEGG通路为：新陈代谢、基因信息处理、环境信息处理、细胞处理、人类疾病、器官系统。共发现 25 条 KEGG 通路，差异有统计学意义(P<0.05)，其中研究组有12条通路显著高于对照组，包括：能量代谢、磷酸戊糖途径、卟啉和叶绿素代谢、细菌趋药性、甘油磷酸脂代谢、甘油酯代谢、细胞骨架蛋白、细胞增长、硫中断系统、糖代谢、植物病原体相互作用、NOD样受体信号通路，见图7。

图6 研究组和对照组KEGG通路相对丰度图

图7 研究组和对照组KEGG通路差异分析图

3 讨论

本研究使用16srRNA高通量测序技术对新疆不同地区糖尿病患者肠道菌群的构成和核心菌群情况进行分析，结果发现研究组和对照组的肠道菌群结构存在显著差异，其中属水平上的5个菌属：克雷伯氏菌属、狄氏副拟杆菌属、普雷沃氏菌属、艾克曼菌属、双歧杆菌属被认为是糖尿病患者和对照者的差异菌属，与糖尿病的发生、发展有着密切的联系。

艾克曼菌属是人类肠道微生物群中的主要细菌种类之一，是维持代谢稳态的重要肠道共生体，目前被推荐为临床上应对肥胖、糖尿病和肝病的新益生菌[13-14]。Rampelli等发现普雷沃氏菌属的功能与肠道微生物群发酵饮食中复杂多糖的能力增加有关[15]，强调了普雷沃氏菌在改善葡萄糖耐量方面的重要性。本研究发现，这些菌群的相对丰度在研究组中显著低于对照组，与大多数研究者所发布的研究结果相同[16-20]。

普拉梭菌属及其分泌的多肽在不同化学诱导的小鼠结肠炎模型中显示出抗炎作用[21]，在对2型糖尿病肠菌相对丰度的研究[22-23]表明普拉梭菌属在糖尿病患者中减少，与本研究结果相反，但亦有研究[24]显示其与胰岛素抵抗呈负相关，在糖尿病患者中呈增多趋势。本研究在筛选比较得到的结果发现1例糖尿病患者中报道甚少的菌属——克雷伯氏菌属，克雷伯氏菌属在研究组中的所占比例明显大于健康人群，同时，采用LefSe方法也鉴定出其是糖尿病相关的潜在菌群标志物之一。克雷伯氏菌属属于正常的胃肠道菌群，是肠杆菌科重要的成员之一，肺炎克雷伯氏菌对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌。相关研究发现[25]，糖尿病患者长期高血糖环境会引起各种细胞蛋白质糖化，糖化终末产物随之形成增多, 克雷伯氏菌属被认为是导致糖尿病患者感染的常见病原体。陈蕾等[26]观察STZ诱导的糖尿病小鼠发现其对克雷伯菌的易感性高于正常小鼠，也有研究显示[27],与健康对照组相比，临床上T2DM 患者合并肺炎克雷伯菌感染多见，因为T2DM 患者免疫力下降感染风险增加。说明克雷伯氏菌属是与糖尿病并发症有密切关系。

综上所述，本研究采用16S rRNA基因测序技术探讨肠道菌群结构在糖尿病中变化的特征，分析糖尿病患者与健康人间肠道菌群，寻找潜在的差异菌群，为糖尿病的诊断和治疗提供新的思路。