microRNAs调节骨免疫微环境的研究进展

刘 畅，李 静，江思婧，牟雁东Δ

(1.川北医学院口腔医学系，四川南充637600 ;2.四川省医学科学院.四川省人民医院口腔科，四川成都 610031)

临床常用自体移植修复大面积骨缺损，然而术后存在一些严重并发症。因而急需寻找具有良好生物安全性及成骨效能的生物替代材料。但生物材料植入后引起的宿主免疫反应决定着生物材料的命运。Arron和Choi两位学者在2000年提出了“骨免疫”这一概念[1]，人们发现骨骼系统与免疫系统紧密相连，并互相作用，免疫细胞也是骨稳态的关键调节因素。因而研究者们将目光转向研究能调节骨免疫微环境的生物材料。研究者们通过改进生物材料的化学性能、表面物理性能及在材料上加载生物因子[2]，赋予生物材料调节骨免疫微环境的能力。microRNAs是一类由21～25个核酸组成的单链非编码小RNA，microRNAs占人类基因组的15%,调控至少30%的蛋白基因编码。已有多种microRNAs作为生物因子被加载到骨组织工程的生物材料中，并在体内外实验中均获得了较好的成骨效果。却鲜有报道microRNAs在骨组织工程中调节骨免疫微环境。

本综述将讨论生物材料植入后的宿主反应、巨噬细胞在骨愈合中的作用、靶向调节成骨细胞及巨噬细胞的microRNAs。试图探寻将具备骨免疫微环境调节能力的microRNA作为生物活性因子加载到生物材料上，未来应用这一策略使生物材料植入体内后靶向调节骨免疫微环境，获得更好的成骨效果。

1 生物材料植入后的宿主反应

生物材料植入体内后会发生一系列的反应，其中包括血液-材料相互作用、临时基质形成、急性和慢性炎症、肉芽组织发育、异物反应和纤维囊形成[2]。多种免疫细胞参与了生物材料植入后的免疫反应。生物材料植入后的纳秒内，血液和间质液蛋白质自发吸附在生物材料表面，引起凝血级联反应。同时触发补体级联反应，产生高浓度的C3a和C5a以募集粒细胞及单核细胞。凝血级联反应产生的纤维蛋白网、激活的血小板，以及补体激活过程中释放的炎症介质，在生物材料表面形成临时基质。随后发生以植入部位存在多形核粒细胞为标志的急性炎症。在植入2天内，多形核粒细胞迅速发生耗竭。肥大细胞通过释放组胺及增强炎性的细胞因子也参与了急性炎症。急性炎症期释放的大量细胞因子会募集单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞。随后进入慢性炎症期，单核细胞/巨噬细胞是参与炎症演变的主要细胞。血液循环中的单核细胞被募集到植入物部位，并分化成巨噬细胞。在伤口愈合的过程中，巨噬细胞吞噬有害物质，并募集其它细胞到损伤部位，同时分泌各种生物因子促进伤口愈合。巨噬细胞具有高度可塑性，可响应局部微环境，分化为M1型促炎表型及M2型抗炎表型。巨噬细胞可以吞噬直径5 μm的颗粒，但M1表型向M2表型转化失败加上吞噬颗粒较大时[2]，在白介素4、白介素13的刺激下巨噬细胞将形成异物巨细胞，异物巨细胞可以吞噬直径高达100 μm的颗粒。并在急慢性炎症消失后，通过识别具有巨噬细胞、血管、成纤维细胞及肌成纤维细胞的“肉芽样组织”，形成肉芽组织。普遍认为肉芽组织是纤维囊形成的前体。免疫细胞导致各种促纤维因子的释放，募集成纤维细胞和内皮细胞，导致纤维组织的形成。免疫细胞的调节功能对于植入物最终向骨再生发展，还是形成纤维囊具有重要作用。研究发现巨噬细胞M1型向M2型的转化可减少纤维组织的生成[3]。进一步说明了调节免疫环境对于植入生物材料骨再生的重要性。

2 巨噬细胞对骨愈合的作用

骨髓为骨细胞和免疫细胞提供相同的微环境，以容纳和共享相互关联的细胞因子和信号通路，使两类细胞骨代谢中紧密联系和互相影响。尽管多种免疫细胞参与了骨组织中的免疫反应，但巨噬细胞通过分泌各种细胞因子发挥着最重要的作用。在骨愈合中发挥作用的巨噬细胞根据细胞来源分为骨巨噬细胞和炎症巨噬细胞(后者由单核细胞分化而来)。在体内骨巨噬细胞紧邻破骨细胞，并且骨巨噬细胞耗尽后影响了骨损伤的愈合，这说明骨巨噬细胞对于骨稳态具有重要作用。而炎症巨噬细胞被认为是组织愈合期间主要的巨噬细胞来源。这些炎症巨噬细胞具有高度的可塑性，可以通过M1、M2表型转化，并分泌各类细胞因子影响骨愈合的过程。现有研究中，microRNAs主要通过调节巨噬细胞M1、M2表型转化，从而影响成骨细胞，影响骨愈合过程。了解巨噬细胞在骨愈合中所发挥的作用，有利于探究microRNAs介导巨噬细胞影响骨愈合的具体机制。

2.1 M1型巨噬细胞干扰素、脂多糖以及巨噬细胞集落刺激因子可刺激巨噬细胞分化为M1表型。M1型巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6等细胞因子影响成骨过程。TNF-α可以介导MSC的定向迁移，通过核因子κB通路增强了骨形成蛋白2、核心结合因子α1等成骨相关基因的表达，提高了碱性磷酸酶活性促进基质矿化。而白介素6敲减的小鼠，骨组织损伤愈合延迟，组织矿化成熟能力减弱[4]。但TNF-α、白介素6也可以促进破骨细胞形成。总而言之，早期的促炎因子可能对成骨有利，但长期的炎症反应会导致异物反应及纤维包裹，引起生物材料植入失败及周围骨组织吸收。

2.2 M2型巨噬细胞与M1型巨噬细胞相反，M2型巨噬细胞在成骨的中晚期起作用，诱导新骨及纤维组的形成。M2型巨噬细胞可分为M2a、M2b、M2c、M2d型，每一种亚型都有特有的表面标志和功能。M2a由白介素4、白介素13刺激产生，分泌大量精氨酸酶1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)促进胶原纤维和成纤维细胞因子产生。M2b由IC/TLR联合激动剂及IL-1R激动剂刺激产生，分泌大量白介素10,同时也分泌白介素1β、TNF-α、IL-6，起平衡炎症环境的作用。M2c由白介素10刺激分化而来，产生大量白介素10及TGF-β，起控制炎症、促进组织重建的作用。M2d巨噬细胞被认为是肿瘤相关巨噬细胞。M2型巨噬细胞通过释放抗炎细胞因子促进了成骨反应。白介素10可以促进成骨细胞分化，在白介素10敲减的小鼠中观察到骨形成减少，羟基磷灰石在体内外实验中依赖白介素10促进骨形成[5,6]。TGFβ可以通过BMP信号通路刺激间充质干细胞成骨分化，以促进成骨。然而，TNF-α、TGF-β1和TGF-β3等因子的长期释放导致会瘢痕组织的形成和伤口愈合过程延迟。

3 调节骨免疫微环境的潜在microRNAs

鲜有文献报道将同时作用于成骨细胞及免疫细胞的microRNAs应用到成骨生物材料上。Marycz等将miR-21、miR-124加载到加入了氧化铁的纳米羟基磷灰石中，在磁场条件下观察到，复合材料降低了脂多糖刺激巨噬细胞产生的炎性因子，提高了小鼠成骨细胞MC3T3-E1的成骨能力[7]。另一项研究利用静电纺聚纳米纤维支架加载两种microRNAs:Let-7c和miR-124，在小鼠体内降低了M1/M2型巨噬细胞比例，促进了植入物与周围组织的骨整合[8]。但这些研究都缺少microRNAs具体影响骨免疫微环境的机制研究。了解同时靶向成骨细胞及免疫细胞的microRNAs,以及具体的作用机制,有利于将这些microRNAs进一步应用于生物材料上，达到理想的成骨效果。

3.1 miR-21miR-21对于巨噬细胞的表型的调节具有组织异质性，对不同的炎性环境其作用也不一致，研究者认为miR-21在调节炎症反应时起着动态作用。Nurrahmah等用脂多糖刺激RAW264.7后发现通过NF-κB通路升高了miR-21表达，并促进了白介素1β、TNF-α、白介素6等炎性因子的表达[9]。而另一些研究则展示了相反的效果。脂肪干细胞分泌的外泌体中含有miR-21,促进了巨噬细胞向M2型分化，并促进了小鼠血管再生[10],血管再生对于成骨也具有重要意义。有趣的是，IL-1β刺激骨髓间充质干细胞后，产生的外泌体中富含miR-21同样促进了M2型巨噬细胞分化[11],这说明miR-21可能是调节成骨细胞、免疫细胞互相作用的重要介质。

miR-21作用于骨髓间充质干细胞时展现出了积极的促成骨作用。在骨质疏松的小鼠中miR-21表达水平降低，而成骨诱导的骨髓间充质干细胞中miR-21表达上升，并且在骨髓间充质干细胞中过表达miR-21可以通过抑制基因功能磷脂酶和张力蛋白同源物促进干细胞成骨分化,抑制其成脂分化[12]。同时，MiR-21被证明可以通过Smad同源物7-Smad同源物1/同源物5/同源物8-Runx2信号轴促进骨髓间充质干细胞成骨分化[13]。

3.2 miR-26a研究发现miR-26a靶向Kruppel样因子4,抑制了巨噬细胞从M1型向M2型转化[14]。也有研究报道miR-26a可以靶向大鼠巨噬细胞toll 样受体3从而减轻炎症[15]。

miR-26a的促成骨作用在众多文献中均已得到了验证。在小鼠体内，慢病毒转染的miR-26a促进了颅骨缺损的愈合[16]。通过靶向成红细胞白血病病毒癌基因同源物2转导因子调节BMP/Smad信号通路，miR-26a对于骨质疏松的小鼠也有积极的治疗作用[16]。miR-26a可以靶向糖原合成酶激酶3β,调节wnt信号通路从而促进骨髓间充质干细胞成骨[17]。在骨组织工程中，miR-26a被搭载到不同的生物材料上，在体内外均得到了较好的成骨效果。

3.3 miR-29miR-29a可以靶向骨髓巨噬细胞细胞的破骨细胞分化因子，从而抑制破骨细胞生成；同时，miR-29a敲减的骨髓间充质干细胞成骨能力减弱，这在小鼠体内也得到了验证[18]。miR-29a也被认为通过核因子κB通路提高了白介素1β、白介素6等促炎因子的释放[19]。

3.4 miR-34a在小鼠的骨髓巨噬细胞中，miR-34a通过细胞因子信号转导抑制因子3/信号转导及转录激活子-1/信号转导及转录激活子-6信号轴促进巨噬细胞M2极化[20]。脂多糖刺激巨噬细胞系RAW264.7后，miR-34a表达降低，过表达miR-34a后，通过把现象Notch同源物1降低了TNF-α等炎性因子的表达[21]。但在不同的组织(如心脏、肺巨噬细胞等)上，miR-34a对于免疫细胞的作用并不同。在人骨髓间充质干细胞中miR-34a可以通过靶向Dickkopf同源物，从而调节Wnt信号通路促进Runx2、骨钙素等成骨相关因子表达[22]。用水凝胶传递miR-34a在体内外均证明了miR-34a的促成骨作用[23]。

3.5 miR-124在不同的体内外模型中，miR-124均抑制巨噬细胞向M1型分化，促进巨噬细胞向M2型分化，并释放抗炎因子。MiR-124靶向了TNF 受体关联因子、信号转导因子和转录激活因子3等多个靶标发挥上述功能[24，25]。同时miR-124对于骨愈合也有积极的作用。在韧带成纤维细胞中，miR-124通过用靶向GSK-3β，调节Wnt信号通路促进细胞成骨分化[26]。羟基磷灰石颗粒搭载miR-124后也展现出良好的成骨能力[7]。纳米纤维支架传递miR-124可以增加植入物周围M2型巨噬细胞表达，降低植入后纤维囊的产生[8]。MiR-124还可以抑制白介素6、TNF-α诱导的破骨细胞生成[27]。

3.6 miR-125aBanerjee等发现miR-125a在M2型巨噬细胞中高度表达，敲减miR-125a后促进了M1型巨噬细胞的分化，miR-125a通过直接靶向Kruppel样因子3参与了巨噬细胞表型大的调节[28]。牙髓干细胞的外泌体富含miR-125a, 过表达的miR-125a直接靶向B 细胞κ 轻肽基因增强子抑制因子抑制NF-κB和Toll样受体信号通路，促进巨噬细胞M2向分化，并释放促成骨因子骨形成蛋白2[29]。这说明miR-125a可能在骨免疫微环境中起着重要作用。miR-125a还被发现可以通过Wnt信号通路促进脂多糖刺激后的人骨髓间充质干细胞成骨[30]。

4 总结与展望

microRNA可以作为调节骨免疫微环境的生物活性因子加载到生物材料上，通过这一策略研发靶向调节骨免疫微环境的生物材料，得到更理想的成骨效果。在microRNAs的选择上，我们认为miR-21、miR-26a、miR-29、miR-34、miR-124、miR-125a可以作用调节骨免疫微环境的生物活性因子。尽管有的microRNAs在免疫和成骨调节上具有争议，但植入体内的微环境比已知的机制更为复杂，仍需进一步验证骨免疫的效果与发挥作用的机制。

尽管microRNAs在共同调节免疫细胞和成骨细胞方面具有较大潜力，但要将其实际应用到生物材料上仍然有很多限制，比如靶向性差、循环时间短和裸miRNA药物可能产生脱靶效应。在组织工程中，已有多种含有细胞和无细胞的支架得到了应用，但仍需要探索更理想的支架材料搭载microRNAs，使其时序释放、靶向局部骨缺损部位，最终达到理想成骨效果。