结核分枝杆菌感染宿主相关生物标志物研究进展

曹景新 综述，李 磊 审校

(西藏大学附属阜康医院：1.呼吸内科；2.实验室，西藏 拉萨 850000)

根据世界卫生组织(WHO)发布的2018年全球结核病报告显示，估计全球23%的人口(约17亿)存在潜伏结核感染；2017年，全球范围内约有1 010万例结核病新发病例，其中男580万例，女320万例；儿童100万例，结核病死亡率约为16%(死亡人数约160万)[1]。我国结核病患者数占全球结核病患者数的9%，是结核病第二高负担国家，2017年估算我国结核病新发患者数为88.9万例，死亡人数约为3.7万例[1]。尽管许多国家已常规接种卡介苗，但该疫苗主要对儿童播散性结核病有效，对成人的疗效仍存在较大争议[2]。为了实现对结核病的全球控制，最重要的是开发有效的新型疫苗和缩短疗程的新型药物，同时，亦迫切需要开发一种低成本、微创、非痰、高度敏感和特异的结核病检测方法，其最好采取易于获取的生物样本，如血液或尿液。另外，通过在治疗早期和治疗结束时能指示有效治疗的生物标志物，预测复发，可以极大地改善结核病临床预后。结核病相关生物标志物可分为结核分枝杆菌相关生物标志物和结核分枝杆菌感染宿主产生的生物标志物，本文主要针对后者的一些最新研究进展进行综述，特别是对活动性结核和潜伏性结核可进行诊断或鉴别诊断，以及在结核病治疗中可进行效果监测的生物标志物。

1 宿主抗体对结核分枝杆菌抗原的应答

感染和免疫力似一枚硬币的两面，当结核分枝杆菌感染时，必然会激活宿主的免疫反应，导致宿主生物标志物的变化。宿主产生的病原体特异性抗体是诊断病原体常用的生物标记物，主要优势为操作简单、价格低廉，也可用于医疗保健。截至目前，针对结核分枝杆菌抗原[如结核菌素、人早期分泌抗原靶6抗体(ESAT-6)、人结核分枝杆菌(CFP-10)和热休克蛋白]的特异性抗体已被广泛研究[3]。但是，上述检测方法表现出的灵敏度(14%～85%)和特异度(53.0%～98.7%)不佳[4-5]。同时，一些结核分枝杆菌抗原，比如ESAT-6和CFP-10不存在于卡介苗菌株的基因组中，因此检测这些抗原的特异性免疫反应可以区分结核分枝杆菌感染与疫苗接种反应[6]。

近年来，几种高抗原性结核分枝杆菌抗原(如Rv0310c-E和Rv1255c-E)已被证明可用于诊断，其灵敏度和特异度明显升高。LUO等[7]研究结果表明，Rv0310c-E和Rv1255c-E特异性抗体IgG用于诊断结核分枝杆菌的敏感度和特异度[受试者工作曲线下面积(AUC)值分别为0.800和0.808]高于ESAT-6和CFP-10(AUC值分别为0.665和0.623)。而LPEZ-RAMOS等[8]研究表明，抗结核分枝杆菌抗原P12037抗体联合sCD14诊断活动性肺结核的敏感度和特异度分别为92%和91%。另有研究发现，抗结核分枝杆菌抗原的抗体，如PPE17和MDP-1可以区分潜伏性结核病患者和活动性结核病患者[9-10]。MAEKURA等[10]研究表明，抗结核治疗后MDP-1抗体持续升高可能与治疗结束后复发有关，认为MDP-1是一个潜在的治疗监测标志物。但也有研究发现儿童对结核分枝杆菌抗原的抗体反应普遍较低[4]。

2 宿主细胞因子对结核分枝杆菌抗原的应答

相对于抗体反应而言，针对结核分枝杆菌特异性抗原的细胞免疫反应具有更好的一致性。结核菌素皮肤试验(TST)已被广泛用于诊断活动性结核和潜伏性结核，但由于交叉反应，该试验不能区分结核分枝杆菌感染、其他非结核分枝杆菌感染或卡介苗接种后反应，同时，TST在免疫受损患者中的敏感性下降明显。受结核分枝杆菌特异性抗原刺激，T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)，其可提示过去或当前感染结核分枝杆菌。近年来，IFN-γ释放试验(IGRA)已成为结核病诊断中较受欢迎的检测方法，IGRA检测的是结核分枝杆菌特异性抗原，如ESAT-6和CFP-10体外刺激全血后IFN-γ的产生。IGRA有2种检测方式，一种是基于ELISA法的QuantiFERON-TB Gold(QFT)检测，另一种是基于酶联免疫斑点法(ELISPOT)的T-Spot检测。相比之下，T-Spot检测活动性结核的灵敏度(91.0%)比QFT的灵敏度(80.2%)更高[11]。总体而言，IGRA比TST具有更高的敏感度和特异度，同时，IGRA受人类免疫缺陷病毒(HIV)感染状况的影响较TST小[12]。另有研究发现，从结核病特定部位(如胸腔积液、支气管肺泡灌洗液和脑脊液)分离的外周血单核细胞进行IGRA检测具有很高的敏感度(90%)和特异度(100%)[13]。活动性结核病患者的IGRA反应一般比潜伏性结核病者更明显，但IGRA不宜适用于活动性结核和潜伏性结核的鉴别诊断，因IGRA中应用的抗原ESAT-6和CFP-10是结核分枝杆菌的分泌蛋白，容易在活动性感染期间出现[14]。ARROYO等[15]研究表明，在IGRA检测中采用潜伏期相关抗原，即休眠生存调节子(DosR)和促进复活因子(Rpf)更有益于鉴别结核病活动与否，DosR蛋白Rv2029c和Rpf蛋白Rv2389c被证明可以鉴别活动性结核和潜伏性结核，其敏感度分别为90%和85%。鉴于IGRA的敏感度和特异度，该检测也被建议用作治疗监测工具。KANEKO等[16]研究显示，治疗结束时IGRA阳性的患者出现结核复活，而IGRA阴性的患者在两年随访中没有出现结核复活。

IGRA作为体外刺激试验的一个优点是同一试管可以通过多重阵列或流式细胞术重复研究其他生物标记物，以获得可能区分结核病不同阶段的生物学特征。IFN-γ下游的IP-10，已被证明是一个潜力很大的生物标记物。研究显示，未刺激的输卵管中血浆IP-10水平的升高与活动性结核有关[17]。IP-10不仅与血液中的IFN-γ一样敏感，而且还能在患有活动性结核的儿童和成人的尿液中进行IP-10检测，使得样本收集更加容易。此外，与IFN-γ不同的是，IP-10受HIV状态的影响较小。上述优点使IP-10成为一种较可靠的生物标志物。

目前，已有多项研究在血浆上应用多重细胞因子微珠阵列来区分活动性结核和潜伏性结核，这些研究分别应用了5～15个生物标志物的组合进行分析，其鉴别敏感度为82.3%～96.7%[18-20]。其中，IFN-γ和IP-10是这些研究中最常用的生物标记物。LUO等[21]通过对38个细胞因子的筛选研究发现，结合应用嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL22和MCP-1这3种细胞因子能鉴别活动性结核和潜伏性结核，敏感度和特异度分别为87.8%和91.8%。与抗结核治疗成功与否相关的潜在生物标志物还包括IL-6、MCP-1、VEGF、血清淀粉样蛋白、IL-11受体拮抗剂和α2-抗纤溶酶等[22-23]，这些生物标记物的具体情况还需要进一步的研究评估和验证。

3 宿主对结核分枝杆菌抗原的细胞免疫应答

流式细胞术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，可以用来分析不同种群中单个细胞的特征。当结核分枝杆菌抗原暴露后，CD4+和CD8+T细胞经历几个阶段的分化，从幼稚T细胞发展到中央记忆T细胞、效应记忆T细胞，最后到终末分化效应记忆T细胞。同时，抗原暴露越多，T细胞分化就越快。基于上述原理，人们也关注与结核病分期相关的T细胞的功能特征(即亚群及其细胞因子的合成)。CD69是一种共刺激受体和早期激活标志物，CD4+CD69+IFN-γ+T细胞水平升高与早期活动性结核病或近期的结核感染有关[24-25]。同样，CD137是一种共刺激受体，负责维持T细胞的有效激活、增殖和存活，其出现频率也被证明与活动性结核有关[26]。

MILLINGTON等[27]研究发现，多功能的CD4+IFN-γ+IL-2+TNF-α+T细胞主要见于活动性结核病患者，而CD4+IL-2+IFN-γ+T细胞和CD4+IFN-γ+T细胞见于潜伏性结核病患者。同时，也有研究表明，非活动性结核(包括潜伏性结核、卡介苗接种或治疗期结核病)主要与CD4+IFN-γ+IL-2+效应记忆T细胞和CD4+IL-2+效应记忆T细胞有关,而活动性结核主要与CD4+IFN-γ+终末分化效应记忆T细胞有关[28]。AHMED等[29]研究发现，活动性结核与CD38+CD27low的频率增加相关，而潜伏性结核与CD38-CD27high的频率增加相关。CD27是TNF-α受体超家族成员之一，在鉴别活动性结核和潜伏性结核中有一定的应用价值。研究发现，CD27和结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞两者与结核分枝杆菌抗原/结核分枝杆菌负荷相关，因此可以作为监测治疗进展的生物标志物[30]。其他T细胞亚群，如IL-10+Th17 T细胞在潜伏性结核病患者中显著升高，而在DosR刺激下，活动性结核病患者IFN-γ+Th17 T细胞显著升高[31]。除了T细胞外，树突状细胞在抗菌免疫方面也发挥着重要作用。有研究发现，BDCA3+树突状细胞和CD123+树突状细胞的占比在活动性结核病患者中明显减少；而在潜伏性结核病患者中该亚型的占比明显增加[32]。

其他表面标志物，如CD38、HLA-DR、Ki-67和骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)的含量被认为可作为监测治疗效果的生物标志物[33]。AHMED等[29]研究发现抗结核治疗9周后，T细胞表面CD38、HLA-DR等免疫激活标志物的表达明显降低。CACCAMO等[34]抗结核治疗的随访研究显示，结核病感染明显好转的患者表现出从CD4+IFN-γ+终末分化效应记忆T细胞向CD4+IFN-γ+IL-2+效应记忆T细胞的转变。在一项关于活动性结核病抗结核治疗的纵向前瞻性研究中，以抗结核治疗开始后71 d为界点，将患者分为两组：71 d内痰培养转阴者为快速反应组，痰培养转阴晚于71 d者为慢反应组，结果发现Treg基因在慢应答者中的频率较高，并且Treg基因可以预测培养转阴的时间，其敏感度为81%，特异度为85%[35]。

4 组学方法在生物标志物研究中的应用前景

组学即基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等的统称。这些组学方法不仅被用于结核病诊断、监测治疗效果、预测治疗结果，而且还被用于提高对结核病发病机制的探索。

一项基因组学研究中，能编码IFN诱导核蛋白的基因Sp110，对rs7580900、rs7580912、rs9061、rs11556887、rs2241525这5个单核苷酸多态性进行分析，结果发现rs9061与潜伏性结核的易感性呈显著相关[36]。进一步的研究表明，携带该单核苷酸多态性的个体血浆TNF-α水平有所降低[37]。一项转录组学研究发现，全血中有393个转录本表征活动性结核病，另有86个转录本，能将结核病与其他感染区分开,且通过分析发现活动性结核病的特征主要由中性粒细胞驱动的IFN诱导基因组成，包括IFN-γ和Ⅰ型IFN-αβ信号[38]。另有研究提出，转录图谱能够区分活动性结核和潜伏性结核[39]。细胞毒性基因转录本也可用于结核病预后评估，以预测结核病复发[40]。

转录组学的研究主要针对mRNA表达谱的研究，近年对mRNA的非编码区的研究关注与日俱增。虽然这些非编码RNA不编码任何蛋白质，但它们具有一定的调节功能，因此可能会因结核病的不同阶段而改变。MIOTTO等[41]通过比较儿童结核、成人活动性肺结核、活动性肺外结核、结核/HIV混合感染和潜伏性结核病患者的microRNA(miRNA)图谱，成功地确定了结核感染常见的15种miRNA特征，其敏感度和特异度分别为82%和77%。circRNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，其高度抵抗核糖核酸酶的降解，因此在细胞中含量丰富且持续时间长。FU等[42]研究发现，结核感染患者中有171个circRNA调控异常，circRNA_103017、circRNA_059914、circRNA_101128升高最明显，而circRNA_062400下降，推测circRNA_103017对结核病的诊断有潜在价值，其次为circRNA_059914和circRNA_101128。CHAKRABARTY等[43]鉴定了几种miRNA，发现两种来自人类的miRNA(hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-125b-5p)和一种来自结核分枝杆菌的miRNA(MTB-miR5)在活动性结核患者中有明显增加。miRNA也被用来鉴别活动性结核和潜伏性结核。LYU等[44]通过研究250个miRNAs发现，hsa-let-7e-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-140-5p在潜伏性结核病患者中呈差异表达，而hsa-miR-1246、hsa-miR-2110、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-28-3p和hsa-miR-193b-5p在活动性结核病患者中存在差异表达。

利用蛋白质组芯片方法，对4 262个结核分枝杆菌抗原进行筛选，发现活动性结核病患者有152个结核分枝杆菌抗原的免疫球蛋白G水平比潜伏性结核病患者呈明显提升，且进一步分析表明，Rv2031c、Rv1408和Rv2421c能够区分活动性结核和潜伏性结核[45]。由于组学方法能够为结核病发生和发展的机制提供更全面的阐述，因此其在预测结核病治疗结果上具有更高准确性。DUFFY等[46]为了提高对结核病进展的了解，通过结合转录组学、代谢组学和通路分析，确定了一组新的免疫代谢信号,涉及皮质醇、色氨酸、谷胱甘肽和tRNA酰化网络，该信号通路与潜伏性结核向活动性结核进展有关。由于结核分枝杆菌特异性免疫反应在人类群体中可能不是同质的，可能受到HIV混合感染、遗传和外源环境因素的影响。所以，组学研究中的变量数量通常比样本量大得多，进而检测合适的生物标志物的统计难度大幅提升。

5 小 结

结核病的诊断及治疗监测对临床决策至关重要，宿主生物标志物对此起着重要作用，但目前临床上可用于结核病检测的生物标志物不是最理想的。宿主对结核分枝杆菌抗原产生的特异性抗体反应普遍较低，但针对结核分枝杆菌特异性抗原的细胞免疫反应具有更好的一致性。IGRA比TST具有更高的敏感度和特异度，IGRA已成为结核病诊断中较受欢迎的检测方法。结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞与结核分枝杆菌抗原负荷相关，因此可作为监测治疗效果的生物标志物。基于组学的技术能够为疾病机制提供更全面的阐述，在预测结核病预后方面也更准确，但仍需进一步探索研究。