生物法制备烟酸关键技术研究

烟酸又称尼古丁酸、维生素B3、吡啶-3-甲酸，是维持人体生理机能所必需的维生素，在医药、化工、食品领域具有广阔的市场前景。目前烟酸的合成主要为化学合成和生物合成两种。化学合成法是目前市场上所采用的主要生产手段，但环境污染严重、能耗高、产能偏低、产业技术先进性严重不足、在国际市场上缺乏竞争力，而且产量无法满足市场需求。生物催化合成法是近年来快速发展的可替代性颠覆技术，具有环境友好、生产成本低等优势。

江南大学、浙江工业大学等对生物法制备烟酸关键技术进行了深入研究，开展了高产菌株选育、高表达菌株构建及分子改造等工作，实现了高底物浓度生物转化工艺的构建与放大优化等。如中国专利CN201710580770.1涉及一种腈水解酶组成型表达体系的构建及其在烟酸合成中的应用，所述的腈水解酶组成型表达载体是通过在pET-3b质粒导入恶臭假单胞菌Pseudomonas putida腈水解酶基因编码序列构建而成，得到重组质粒pET-3b-NIT，转化至E.coliBL21(DE3)中得到无需进行体外诱导的组成型重组腈水解酶表达菌株，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coliNIT-1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14254。进一步采用pH-stat补料策略进行精确调控以提升菌体密度和腈水解酶产量，并以大肠埃希氏菌游离细胞为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，通过批次投料的方式进行连续转化生产烟酸。CN201710593822.9公开了一种高产腈水解酶的重组枯草芽孢杆菌及其在烟酸合成中的应用，该方法通过PCR扩增恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaCGMCC 3830腈水解酶基因编码序列并与pMA5质粒相连，构建得到重组质粒pMA5-NIT，转化至Bacillus subtilisWB600中得到可高效表达腈水解酶的重组菌B.subtilisWB600(pMA5-NIT)，命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisNIT-2，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14255。以重组枯草芽孢杆菌游离细胞为催化剂，可将3-氰基吡啶完全转化生成烟酸。CN201710666240.9提供一种含腈水解酶的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida突变体mut-D3的细胞复合固定化方法及其在烟酸制备中的应用。该发明具体是将海藻酸钠溶液与PVA(聚乙烯醇)按照一定比例混合，作为固定材料，再与制备好的菌悬液混合，滴入预冷的固化液中进行固定。获得的固定化细胞对高浓度底物耐受性大大增强，可应用于烟酸的高效转化合成，相比于游离细胞烟酸产量提高约2倍。CN201310570085.2涉及一种将产腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia，CGMCC No.4903）用聚乙烯醇-壳聚糖、海藻酸钠-明胶复合材料固定化并分别用戊二醛和京尼平进行交联处理后用于制备烟酸的方法。研究发现，用京尼平交联处理的壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞保留活力和重复利用性比戊二醛交联处理的固定化细胞要好，并且比海藻酸钠-明胶复合材料活力高。可以重复利用多次，有较高的底物耐受性，能提高单位菌体的生产能力。CN201210386670.2公开了一种再育镰刀菌（Fusarium proliferatum）ZJB-09150及在生物合成烟酸中的应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M2011472，保藏日期2011年12月15日。所述合成烟酸的方法为：以再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，于pH 7.0～10.0的缓冲溶液中构成转化反应体系，在35～55℃条件下进行转化反应，反应完全后，转化反应液即为含烟酸的混合液，混合液分离纯化获得所述烟酸。商玉婷等采用氨基化核壳结构磁性Fe3O4纳米粒子对重组腈水解酶进行固定化并对制备条件进行优化。并通过考察磁性固定化细胞的温度稳定性、底物耐受性和初始底物浓度对转化效率的影响，确定磁性固定化细胞转化3-氰基吡啶为烟酸的工艺条件,以进一步增强重组腈水解酶的烟酸生产能力。李禾研究了敏捷嗜酸菌来源腈水解酶的分子改造及在烟酸生产中的应用，从敏捷嗜酸菌Acidovorax facilis72W中克隆腈水解酶编码基因，实现了其在大肠杆菌中的高效异源表达，并对腈水解酶NitA的酶学性质与生物催化性质进行表征。进一步针对腈水解酶NitA催化活性低、热稳定性差等问题，通过定点突变与随机突变等手段筛选到酶活力提高与稳定性增强的突变体NitA-C2和H135A。

随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，我国对烟酸及其衍生物的需求将迅速增加。研究人员应大力开发和研制新的烟酸及其衍生物的合成路线，寻求生产工艺简单、环境友好、绿色化学的发展方向，合成更高效的医药、食品添加剂等方面的精细化工产品。