雷公藤次碱通过调控TLR4/MyD88/TRAF6 信号通路抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症反应

汪 滢，张敏新，林 兵 （中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院, .临床药学科；. 药剂科, 福建 福州350025）

雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的干燥根，是一种公认的同时具有较强药效和较强毒性的中药材，广泛用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、系统性红斑狼疮等疾病[1]。但其毒性较大，不良反应高发且严重，常使患者不能耐受[2]。雷公藤的主要有效成分为二萜类、三萜类和生物碱类，研究表明各种成分均具有不同程度的抗炎、抗肿瘤和免疫抑制等活性[3-4]，其中生物碱的毒性要小于二萜和三萜类成分，临床应用具有疗效好，不良反应较小的特点[5]。雷公藤次碱是雷公藤生物碱中含量较高的一种倍半萜类单体化合物。目前研究显示其具有良好的杀虫活性，其他药理活性和机理研究较少，特别是抗炎和免疫抑制活性方面。

本研究主要通过建立脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7 细胞炎症模型，探讨雷公藤次碱对LPS诱导的炎性因子NO，IL-1β，TNF-α 和IL-6 释放的影响，用免疫印迹法考察雷公藤次碱对TRAF6、IRAK、NF-κB、IκBα、JNK、ERK、p38 等关键蛋白表达或磷酸化的影响，探讨其可能的抗炎作用机制，为促进雷公藤次碱的应用研究提供基础。

1 试剂与材料

雷公藤次碱（纯度98%，上海纯优生物科技有限公司）；DMEM 细胞培养基、胎牛血清（Life Technologies GIBCO）；Griess 试剂、细胞计数盒-8(CCK-8)（上海碧云天生物技术有限公司）；脂多糖（LPS， Sigma-Aldrich）；IL-1β、TNF-α 和IL-6 检测试剂盒（达科为生物技术有限公司）；核质提取试剂盒（Dojindo Laboratories）；TRAF6、IRAF、p-IRAF、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65、β-actin、HRP 山 羊 抗 兔 抗 体（Cell Signaling Technology）；RAW264.7 细胞购自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 RAW264.7 细胞培养及炎症模型建立

RAW264.7 细胞在含10%的新生小牛血清及100 U/ml 青霉素、链霉素的DMEM 高糖培养液中进行培养，培养条件为5%CO2、37 ℃，隔天换液，每日观察细胞的生长状况。实验时取对数生长期RAW264.7 细胞，胰酶消化，加入新鲜培养基反复吹打成细胞混悬液，细胞增殖实验、细胞因子分泌含量测定调整细胞浓度为1×105cells/ml，以每孔100 μl 细胞悬液接种于96 孔细胞培养板中，细胞蛋白表达测定调整细胞浓度到2.25×105cells/ml，以每孔2 ml 接种于6 孔细胞培养板中，然后细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。在药物处理前2 h 给予LPS 溶液（使其终浓度为1 μg/ml）诱导RAW264.7 细胞发生炎症反应建立模型。设空白组（不给予LPS 和药物处理）、模型组（给予LPS 处理）、药物组（给予LPS 诱导后再给予相应浓度的药物进行处理），每组设6 个复孔(n=6)。

2.2 RAW264.7 细胞增殖实验

设空白组和药物组，药物组分别给予终浓度为200、100、50 和25 μmol/L 的雷公藤次碱药液进行处理。细胞分别培养24 和48 h，实验结束4 h前加入10 μl CCK-8 试剂，结束后以酶标仪于450 nm处检测吸光度（A）。

2.3 RAW264.7 细胞分泌NO、IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量的测定

设空白组、模型组和药物组，药物组细胞给予LPS 诱导后分别给予终浓度为100、50、25 μmol/L的药液进行处理。细胞培养24 h 后取出，吸取细胞上清液，Griess 试剂法检测上清中NO 光密度值，ELISA 试剂盒检测上清中IL-1β、TNF-α 和IL-6的光密度值。

2.4 RAW264.7 细胞中TRAF6、NF-κB p65、IκBα、IRAK、p-IRAK、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK和ERK 表达分析

设空白组、模型组和药物组，药物组细胞给予LPS 诱导后分别给予终浓度为100、50、25 μmol/L的药液进行处理。细胞培养24 h 后取出，用4 ℃预冷的PBS 液洗涤各孔两次，然后，吸弃PBS 液，每孔中加入200 μl 4 ℃预冷的RIPA 提取细胞蛋白，在13 000 r/min 下离心20 min，弃去上清，得各样本。用Bradford 法对蛋白定量；使用细胞核/质提取试剂盒制备用于检测p65/NF-κB 的胞质和核提取物。每孔加入20 μg 蛋白上样，在SDS-PAGE凝胶中电泳，蛋白转移到PVDF 膜上，用BSA 封闭2 h。分别用相应一抗4 ℃孵育过夜，然后用与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶1 000）孵育2 h。最后用 ECL 超敏发光液显影，于凝胶成像仪中曝光，使用 LAS 成像软件对条带进行定量分析

2.5 统计分析与灰度分析

3 结果

3.1 雷公藤次碱对RAW264.7 细胞活力的影响

图1 显示了不同浓度雷公藤次碱对RAW264.7细胞的细胞毒性作用。给予雷公藤次碱（25～200 μmol/L）孵育24 h 后，200 μmol/L 雷公藤次碱可显著抑制RAW264.7 细胞活性；孵育48 h 后，50、100 和200 μmol/L 雷公藤次碱均可显著抑制RAW264.7 细胞的活性。

图1 雷公藤次碱对RAW264.7 细胞活力的影响

3.2 雷公藤次碱对LPS 刺激RAW264.7 细胞分泌炎症因子的影响

为了进一步研究雷公藤次碱体外抗炎活性，检测了雷公藤次碱对LPS 刺激RAW264.7 细胞分泌炎症因子的影响。结果显示（图2），给予LPS 刺激后的RAW264.7 细胞，NO、IL-1β、TNF-α 和IL-6等促炎因子释放水平急剧增加（P<0.01），给予不同浓度雷公藤次碱（100、50 和25 μmol/L）处理后，上述因子分泌水平呈剂量依赖性显著降低（P<0.01）。由此提示，雷公藤次碱的抗炎作用可能与抑制细胞释放NO、IL-1β、TNF-α 和IL-6 等促炎因子有关。

图2 雷公藤次碱对LPS 诱导RAW264.7 细胞分泌炎症因子的影响

3.3 雷公藤次碱对IRAK 磷酸化和TRAF6 表达的影响

LPS 是引发炎症的早期关键因素，可诱发多种细胞内信号事件，LPS-TLR4/MyD88 信号通路可调节促炎基因表达，并控制炎症相关细胞因子的表达，其中IRAK 及TRAF6 是MyD88 依赖性途径中的关键信号传导的分子。TLR4 受体受LPS 诱导后，可导致IRAK 磷酸化从而脱离MyD88 与TRAF6的结合体，使得游离的TRAF6 活化后续信号转导途径[6]。为了评估雷公藤次碱对LPS 激活TLR4/MyD88 信号通路的影响，蛋白印迹法考察了雷公藤次碱对IRAK 磷酸化和TRAF6 表达的影响。结果显示（图3），与空白组相比，LPS 刺激的模型组IRAK 磷酸化和TRAF6 表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比，雷公藤次碱各剂量组可显著抑制IRAK 磷酸化和降低TRAF6 表达（P<0.01）。

图3 雷公藤次碱对TRAF6 表达和IRAK 磷酸化的表达的影响

3.4 雷公藤次碱对IκBα 磷酸化和NF-κB p65 核转位的影响

NF-κB 是MyD88 信号通路中重要的转录因子[7]。我们考察了雷公藤次碱对LPS 诱导的RAW264.7 细胞中NF-κB 活化的潜在影响。如图4 所示，RAW264.7细胞LPS 刺激后，细胞核内NF-κB p65 水平增高而细胞质内NF-κB p65 水平降低，说明NF-κB p65 活化后由细胞质进入到细胞核内，而给予雷公藤次碱处理后，细胞质内NF-κB p65 水平增高而细胞核内NF-κB p65 水平降低，说明雷公藤次碱以浓度依赖的方式显著地阻止了NF-κB p65 从细胞质转运到细胞核。 NF-κB p65 易位进入核内与TLR4途径中的IκBα 磷酸化有关。因此，我们考察了雷公藤次碱对NF-κB 抑制蛋白IκBα 磷酸化的影响。结果表明，雷公藤次碱以浓度依赖的方式显著抑制LPS 诱导的IκBα 磷酸化和降解。

图4 雷公藤次碱对IκBα 磷酸化和NF-κB 核转位的影响

3.5 雷公藤次碱对p38, ERK 和JNK MAPKs 磷酸化的影响

MAPKs 是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。为了进一步研究雷公藤次碱是否调节MAPKs，考察了其对LPS 诱导的RAW264.7细胞中ERK、p38 和JNK 等MAPKs 磷酸化的影响。如图5 所示，LPS 暴露可显著促进RAW264.7细胞中ERK、JNK 和p38 的磷酸化。给予雷公藤次碱可以显著抑制LPS 诱导的ERK、p38 和JNK的磷酸化，但并未影响ERK、p38 和JNK 的表达。上述结果表明，MAPKs 的磷酸化可能参与了雷公藤次碱对RAW264.7 细胞中LPS 刺激炎症的抑制作用。

图5 雷公藤次碱对p38, ERK 和JNK MAPKs 磷酸化的影响

4 讨论

雷公藤次碱是雷公藤的代表性生物碱成分之一，但是自从被分离以来，其生物学活性除了杀虫外，其他方面了解甚少[8]。本研究显示，雷公藤次碱对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型显示出显著的抗炎活性。雷公藤次碱可减少LPS 刺激引起的NO、IL-1β、TNF-α 及IL-6 等促炎因子的产生，并抑制LPS 诱导的TLR4/MyD88 通路中信号传导的分子IRAK 磷酸化及TRAF6 表达，从而影响MAPKs 和NF-κB 的激活，如图6 所示。

图6 雷公藤次碱抗炎调控机制

已有证据显示，LPS 可引发多种细胞内信号事件，包括导致TLR4，NF-κB 及p38，ERK 和JNK 等丝裂素活化蛋白激酶（MAPKs）途径激活[9-10]。研究发现，LPS 诱导后RAW264.7 细胞Toll 样受体4（TLR4）的表达明显增高，说明LPS 是或可引导TLR4 的配体与TLR4 结合，二者结合后可启动细胞内一系列信号级联反应，最终诱导目的基因的表达。TLRs 亚型中除TLR3 外，均需要髓样分化因子88（MyD88）来激活下游释放信号分子的通路，这种途径成为MyD88 依赖性途径。静息状态下，MyD88 与IRAK 及TRAF6 形成细胞信号转导复合物，受到诱导后导致IRAK 磷酸化，IRAK 磷酸化后TRAF6 从信号转导复合物中解离出来，TRAF6的活化可引起两条不同的信号转导途径，一条为MAPK 家族（包括p38、JNK），另一条为活化MP3K（mitogen activated protein kinase kinase kinase）家族成员NIK（NF-κB inducing kinase），后者的磷酸化激活IκB 激酶，导致IκB 的磷酸化而使NF-κB/IκB复合物解离，NF-κB 由此活化转位进入细胞核[11]。在本研究中，数据显示雷公藤次碱可以抑制IRAK磷酸化和TRAF6 的表达。

NF-κB 是一种多效性的转录因子，参与调控炎症反应、免疫、肿瘤等相关的细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎症介质等的转录过程。IκB 是其抑制蛋白，正常情况下二者结合而使NF-κB 处于失活状态，IκBα 是IκB 的亚分子，受到LPS 刺激，IκBα 磷酸化增加，从而导致游离NF-κB p65 释放并从细胞质转移至细胞核，与DNA 上的相应位点结合，导致特定靶基因（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）的转录表达[12-13]。在本研究中，数据显示雷公藤次碱可抑制IκBα 磷酸化，并以浓度依赖的方式阻止NF-κB p65 由细胞质进入细胞核，从而阻止炎症相关因子的转录表达。

此外，NF-κB 的易位也受ERK、p38 和JNK 等丝裂素活化蛋白激酶途径调节，该途径可控制炎症反应过程中细胞因子的合成和释放。丝裂素活化蛋白激酶激活后，细胞质或细胞核中的转录因子又被激活，从而触发引起生物学反应的靶基因的表达，包括促炎性介质的表达。本研究显示，LPS 诱导的RAW264.7 细胞中，雷公藤次碱可显著抑制ERK、JNK 和p38 的磷酸化。