在体单向灌流法研究阿哌沙班肾衰大鼠肠吸收特性

张 欢，汪 丽，张 优，谢 沛，李 娜，丁家荣，王 雷 （1. 海军军医大学第一附属医院：a. 肾脏病科, b. 消化内科, 上海 00433; . 上海大学转化医学研究院, 上海 00444）

临床流行病学显示，终末期肾脏病患者发生房颤的风险是一般人群的10 倍[1]。口服抗凝剂是预防房颤血栓形成的重要治疗方法，但现有口服抗凝剂缺乏针对终末期肾脏病患者的临床研究，其安全性和有效性并不确切[2-3]。阿哌沙班是一种新型口服Xa 因子的抑制剂，广泛应用于预防和治疗血栓形成。研究显示，阿哌沙班可降低肾病合并房颤患者的大出血、血栓栓塞和死亡风险，为此类患者提供新的抗凝药物选择[3]。但阿哌沙班缺少在终末期肾脏病患者（血肌酐清除率<15 ml/min）中使用的临床资料，且目前阿哌沙班肠道吸收部位尚不明确，其吸收的影响因素也不清楚，因而，一定程度上限制了其应用。本实验拟通过探究阿哌沙班在肾衰大鼠肠道内的吸收部位、吸收机制以及P 糖蛋白抑制剂对其肠道吸收的影响，以便为阿哌沙班在终末期肾脏病患者中使用提供一定的参考依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

岛津LC-2030 Plus 高效液相色谱仪、AUW120D电子天平（日本岛津公司）；UVF 超纯水器（上海和泰仪器有限公司）；超声清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；Hei-Tec 磁力搅拌器（德国海道尔夫）；SHZ-D 循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

1.2 实验试剂

阿哌沙班原料药（武汉嘉叶生物科技有限公司）；十二烷基硫酸钠（南京化学试剂有限公司）；氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、二水合盐酸二氢钠、氯化镁、氯化钙、葡萄糖、乙酸铵（上海国药集团）；甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈股份有限公司）。

1.3 实验动物

SD 雄性大鼠，230～250 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。动物自由饮水、进食，环境温度22～25 ℃，相对湿度60%，光照时间8:00—18:00。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。

2 实验方法和结果

2.1 实验溶液配制

2.1.1 Kreb-Ringer's 营养液（K-R 氏液）

精确称取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、MgCl2·6H2O 0.02 g、NaH2P040.32 g、NaHCO31.37 g，用超纯水溶解后加入0.37 g CaCl2至溶解完全，临用前加入葡萄糖1.4 g，转移至1 000 ml 容量瓶中定容至刻度，调节pH 至7.4。

2.1.2 阿哌沙班储备液

精确称取9 mg 阿哌沙班原料药置于容量瓶中，加入3 % SDS，定容至100ml，作为阿哌沙班储备液备用。

2.1.3 不同浓度的阿哌沙班肠循环液

分别取0.5、1.0、4.0ml 阿哌沙班储备液至100 ml容量瓶中，加入K-R 营养液，超声溶解后定容至100ml，配置成的阿哌沙班溶液浓度分别为0.45、0.90、3.60 μg/ml。

2.1.4 含P 糖蛋白抑制剂的阿哌沙班供试液

精确称取0.5g 的盐酸维拉帕米置于100 ml 容量瓶中，加入超纯水溶解配制成浓度为5 mg/ml 的盐酸维拉帕米储备溶液。分别取1 ml 盐酸维拉帕米储备溶液和1 ml 阿哌沙班储备溶液置100ml 容量瓶，配制成含盐酸维拉帕米浓度为50 μg/ml、阿哌沙班浓度为0.9 μg/ml 的供试品溶液。

2.2 高效液相色谱检测

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Gemini 5u C18110A 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A 相为 甲醇，B 相为10 mmol/L 醋酸胺溶液；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。

2.2.2 专属性实验

分别取空白K-R 溶液、阿哌沙班K-R 溶液以及阿哌沙班K-R 回流收集液，2000 r/min 离心5 min后取上清液10 μl，按照“2.2.1”项下色谱条件进样分析[4-5]。结果见图1。实验结果表明，肠灌流液中阿哌沙班峰形良好，保留时间约为7 min，空白K-R溶液及空白肠灌流液对其无干扰，专属性良好。

图1 阿哌沙班的HPLC 色谱图

2.2.3 阿哌沙班的线性关系

精密量取阿哌沙班标准储备液用K-R 溶液配制系列标准溶液，各取1 ml 加入0.5 ml 甲醇，离心后取上清液，按照“2.2.1”项下方法进样分析。线性回归分析结果表明阿哌沙班在0.36-4.5 μg/ml 范围内线性关系良好。

2.2.4 阿哌沙班的回收率试验

精密量取阿哌沙班标准储备液用K-R 溶液配制浓度呈0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班供试品溶液，各取1 ml 加入0.5 ml 甲醇，离心后取上清液，按照“2.2.1”项下方法进样分析，计算阿哌沙班在低、中、高浓度溶液中的回收率。低、中、高浓度溶液中阿哌沙班平均回收率分别为97.39 %、98.91 %、99.92 %，RSD 分别为1.94 %、1.88 %、1.25 %，结果表明本方法准确度良好。

2.2.5 阿哌沙班的稳定性考察

精密量取阿哌沙班标准储备液用K-R 溶液配制浓度为0.45、0.9、3.6μg/ml 的阿哌沙班供试品溶液，置于37 ℃水浴3 h，考察药物在K-R 液中的稳定性。结果0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班供试液的 RSD 分别为 0.51 %、1.65 %、0.50%，表明3 h内阿哌沙班的稳定性良好。

2.3 阿哌沙班大鼠肠吸收特性的研究

2.3.1 大鼠慢性肾功能衰竭模型建立

雄性SD 大鼠适应性饲养1 周后按剂量40 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠，待麻醉成功后，取仰卧位固定，常规消毒，沿左腹旁肾脏位置切开皮肤并逐层分离皮下组织进入腹腔，暴露左侧肾脏，切开上、下极的包膜，采用针形电烧灼器分别在左肾上、下极电凝肾脏表面，逐层缝合肌层和皮肤，关闭腹腔。2 周后，沿右腹旁肾脏位置处切口切开皮肤，逐层分离皮下组织进入腹腔，暴露右侧肾脏，用丝线结扎右肾肾门，切除右肾。

2.3.2 肾衰大鼠单向肠灌流模型的建立

取慢性肾功能衰竭大鼠，禁食12 h，期间自由饮水，按剂量40 mg/kg 腹腔注射1%戊巴比妥钠，待麻醉成功后，取仰卧位固定，常规消毒皮肤。沿腹中线取长约3 cm 纵行手术切口，分别在十二指肠、空肠、回肠、结肠处各取间距约为10 cm 两个微小切口，分别在两切口处置入无菌引流管，并用丝线固定。取预热至37 ℃的生理盐水冲洗肠道内容物，直至澄清液体，引流管连接恒流泵，以2.0 ml/min 的起始流速将浓度为0.9 μg/ml 的阿哌沙班溶液泵入肠段，待肠段内药液充满后将流速降低至0.2 ml/min，此后按15 min/次的频率收集肠回流液，计算肠回流液的质量减少量及15 min 内收集到的流出液体的质量，并测定收集液中药物浓度。实验持续时间2 h。样品采集完后处死大鼠，剪下所研究的肠段，将其平铺，测量其长度以及横截面半径。

2.3.3 肠吸收参数的计算

采用质量法对回流液流入和流出体积进行校正。按下式计算吸收速率常数（Ka）和表观渗透系数（Papp）：

式中Vin和Vout分别为灌入和收集的回流液体积（ml），Cin、Cout分别为进口和出口处回流液中药物的质量浓度（μg/ml），v为灌流速度（ml/min），r为被灌流肠段的横截面半径（cm），L为被灌流肠段的长度（cm）。

2.3.4 阿哌沙班在慢性肾衰大鼠各肠段吸收情况测定

根据测定收集液中阿哌沙班浓度，计算不同肠段中阿哌沙班Ka和Papp，结果发现空肠对阿哌沙班的吸收速率最快，结肠段最慢，结果具有统计学意义。各肠段间的阿哌沙班表观吸收系数未见明显异常。如表1 所示。

表1 不同肠段药物吸收速率常数和表观吸收系数(n=6)

2.3.5 阿哌沙班浓度对其吸收特性测定

配制浓度分别为0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班灌流液，按“2.3.2”项下操作流程选取肾衰大鼠回肠进行灌流，测定灌流液中阿哌沙班的浓度，计算药物Ka和Papp。结果显示，在回肠段，阿哌沙班药物浓度越高，肠道对其吸收速率和表观吸收系数越低（P<0.05），如表2 所示。

表2 回肠不同浓度药物吸收速率常数和表观吸收系数(n=6)

2.3.6 P-gp 抑制剂对阿哌沙班吸收特性的影响

按“2.1.4”项下方法配制含盐酸维拉帕米的阿哌沙班灌流液，按“2.3.2”项下操作流程选取大鼠空肠及回肠进行灌流，测定灌流液中阿哌沙班的浓度，计算药物Ka和Papp，研究P-gp 外排作用对阿哌沙班在空肠和回肠段的吸收特性影响。结果显示，加入维拉帕米后，阿哌沙班的Ka和Papp的值均增加，提示阿哌沙班是 P-gp 的底物，P-gp 抑制剂显著促进阿哌沙班的肠吸收，如表3 所示。

表3 P-gp 抑制剂对阿哌沙班在空肠和回肠段吸收特性的影响(n=6)

3 讨论

阿哌沙班是新型口服、高效、高选择性的Xa因子抑制剂，自2013 年上市以来，随着应用的推广，阿哌沙班适应证由早期的关节置换术后预防静脉血栓形成逐渐拓展为广泛的预防和治疗血栓的形成[6-10]。慢性肾脏病是临床常见病和多发病[11]。研究显示，相对于健康人群，终末期肾脏病患者发生房颤的风险增加10 倍，严重危及终末期肾脏病患者的生命安全[1]。房颤是临床最常见的心律失常疾病，其极易诱发血栓形成，抗凝治疗是房颤病人预防血栓形成及栓塞的必要治疗手段[12]。但目前临床上常见的口服抗凝剂均缺乏针对肾脏病患者的临床研究，其安全性和有效性存疑[3,8,13]。在一项和华法林的对比中发现，相对于华法林，阿哌沙班可降低终末期肾脏病合并房颤患者的大出血、血栓栓塞和死亡风险[3]。此外有研究发现，肾功能损伤对阿哌沙班血浆浓度与抗FXa 活性的关系无明显影响[14]。这也给这部分患者带来了新抗凝剂的选择。然而，对于其肠道主要吸收部位及吸收机制了解欠缺也在一定程度上限制了其临床的应用。

本研究通过比较肾衰大鼠不同肠段药物浓度的测定来推测阿哌沙班在肠道内的吸收部位及吸收机制，并通过给予P 糖蛋白抑制剂来研究其对肠道吸收阿哌沙班的影响。目前研究胃肠道对药物吸收情况的方法主要分为在体实验、体外实验和体内实验三种[15]。其中在体实验又分为两种：循环灌流法和单向灌流法[15-17]。单向灌流法具有通用性好、耗时少及流速低的特点，同时显著减少了对肠道生理环境的影响，最终实验准确性高[16,18]。在本实验所测定的阿哌沙班因其溶解性低、渗透性差及难以被吸收的限制，导致肠道对酚红吸收增加，对实验结果测算校正影响大，故选用单向肠灌流法进行试验以及重量法进行校正计算[19]。

有文献报道[20]，当药物的Papp小于 0.03×10−4cm/s时表明该药物吸收较差；Papp大于0.2×10−4cm/s 时表明该药物吸收完全；而介于两者之间则为中等吸收。阿哌沙班在十二指肠、空肠、回肠、结肠的Papp值均保持约0.2×10−4cm/s，说明阿哌沙班在各肠段均有良好吸收行为。此外，高血压是慢性肾衰患者最常见的并发症，常需使用多种降压药物联合治疗，P-gp 抑制剂维拉帕米作为经典的钙通道拮抗剂广泛应用于临床降压治疗。既往研究显示，阿哌沙班和利伐沙班可被细胞色素P450 3A 和P-gp 所消除[21]。为进一步明确P-gp 对阿哌沙班的吸收影响，本研究观察了P-gp 抑制剂盐酸维拉帕米对阿哌沙班肠道吸收的影响，结果表明加入P-gp 抑制剂后，阿哌沙班在空肠和回肠段Ka和Papp值均有不同程度的增加，推测阿哌沙班是P-gp 的底物， P-gp抑制剂的加入有利于增加阿哌沙班的吸收程度，从而提高阿哌沙班口服生物利用度。不同浓度的阿哌沙班溶液在回肠的吸收情况不同，低浓度与高浓度之间存在显著性差异，且高浓度的Ka及Papp的值最小，表明阿哌沙班的吸收存在自身浓度抑制，其吸收机制应为主动转运。

综上所述，阿哌沙班在各肠段均有吸收；P-gp抑制剂对阿哌沙班在空肠和回肠段的吸收均有明显的促进作用，表明阿哌沙班为P-gp 底物，推测其吸收机制为主动转运。本文拟通过探究阿哌沙班在肠道内的吸收部位、吸收机制以及P 糖蛋白抑制剂对其肠道吸收的影响，为今后阿哌沙班的使用提供一定的参考依据。