极地海绵共附生放线菌Streptomyces sp. LHW11-07 次生代谢产物研究

卢静容，刘雅葳，代 影，林厚文，杨 帆 （. 上海交通大学医学院附属仁济医院药学部, 上海 007；. 沈阳药科大学中药学院, 辽宁 沈阳 006；. 上海海洋大学食品学院, 上海 006）

放线菌以其能产生结构新颖且有良好生物活性的先导化合物而备受关注[1]，一直被认为是天然药物的重要生产者，其主要结构类型包括聚酮、生物碱、多肽和萜烯类化合物等，同时涵盖了多种多样的生物活性如抗菌、抗寄生虫、免疫调节、抗炎、抗癌等[2-4]，这突显了放线菌具有不可预估的药物开发潜力。

随着研究的深入，陆地和普通环境中的资源日趋枯竭，很多微生物及其次生代谢产物被重复开发和提取分离，发现新活性分子的几率愈来愈低，开发创新药物的难度越来越大[5-6]；而极地极端的生态环境造就的微生物具有产生更为特别的化学骨架和活性次生代谢产物的能力，是新型药源分子的重要来源。本文以采自北极楚克奇海域海绵共附生放线菌Streptomycessp. LHW11-07 为研究对象，从其发酵浸膏中分离鉴定了9 个单体化合物1～9（图1），其中化合物1和2为该属内首次分离得到。

图1 化合物1～9 的化学结构

1 材料和方法

1.1 实验仪器与试剂

AMX-600 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Xevo G2-XS Q-TOF 液 质 联 用 仪、 1525/2996,2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；半制备型HPLC 色谱柱（Atlantis Prep T3，美国Waters公司；YMC C18，日本YMC 公司）；中压柱色谱仪（法国Interchim 公司）；恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；N-1000 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；反相ODS 硅胶和Sephadex LH-20 柱色谱填料（Pharmacia 公司）；正相硅胶（200-300 目）和TLC 薄层板（烟台江友硅胶开发有限公司）；分析级试剂（上海化学试剂公司）；色谱级试剂（德国Merck 公司）；氘代试剂（美国剑桥同位素实验室公司）。

1.2 菌株的来源及鉴定

菌株分离于北极海域来源的海绵样本，经16S rRNA 基因序列鉴定为Streptomycessp.，编号为LHW11-07，菌种保存于上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心。

1.3 菌株的大发酵

培养基为ISP2：葡萄糖（4 g/L）、酵母提取物（4 g/L）、麦芽糖提取物（10 g/L）以及海盐（25 g/L），加水溶解后调节pH 为7.2～7.4，分装后高压灭菌20 min (121 ℃)，冷却备用。

挑取Streptomycessp. LHW11-07 单菌落至1 级种子培养基里（100 ml ISP2培养基至250 ml 三角瓶），置于30 ℃，220 r/min 的恒温摇床培养3 d，得1 级种子液；将1 级种子液按5%接种量接到2 级种子培养基里（150 ml ISP2培养基至500 ml 三角瓶），置于30 ℃，220 r/min 的恒温摇床培养3 d，得2 级种子液；将2 级种子液按5%接种量接到大发酵培养基里（700 ml ISP2培养基至2 L 三角瓶），置于30 ℃，220 r/min 的恒温摇床培养7 d，共得到发酵液50 L。

1.4 发酵产物的提取与分离

菌株培养7 d 后，用等体积的乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩得粗浸膏9.8 g。粗浸膏先经凝胶柱分离，二氯甲烷：甲醇（1∶1）的混合溶剂进行洗脱，得到组份Fr.1～Fr.7。

组份Fr.4 经正相中压柱色谱分离（二氯甲烷：甲醇100:0～0:100），得到组份Fr.4a～Fr.4j。组份Fr.4d 再经反相中压柱色谱分离（10%～100%乙腈水），得到组份Fr.4d1～Fr.4d8，Fr.4d2 和Fr.4d3 用反相半制备HPLC 纯化（35%甲醇水，YMC C18），分别得到化合物1 (12 mg,tR=26 min)和2 (47.6 mg,tR=30 min)；Fr.4d6 用反相半制备HPLC 纯化（49%甲醇水，YMC C18），得到化合物3 (8.4 mg,tR=23 min)和4 (2.0 mg,tR=30 min)；组份Fr.4g 再经凝胶柱纯化，洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇（4∶5∶1），得到组份Fr.4g1～Fr.4g11，其中Fr.4g3 用反相半制备HPLC 纯化（25%乙腈水，YMC C18），得到化合物5 (1.2 mg,tR=18 min)。

组份Fr.7 经反相中压柱色谱分离（10%～100%乙腈水），得到组份Fr.7A～Fr.7D。组份Fr.7A 用反相半制备HPLC 纯化（20%乙腈水，YMC C18），得到化合物6 (18 mg,tR=19 min)和7(3.4 mg,tR=25 min)；组份Fr.7B 经正相中压柱分离（石油醚：丙酮100:0～0:100），得到组份Fr.7B1～Fr.7B9，Fr.7B4 用反相半制备HPLC 纯化（88%乙腈水，Atlantis Prep T3），得到化合物8 (12 mg,tR=23 min)和9 (8.4 mg,tR=26 min)。

2 结构鉴定

化合物1：淡黄色固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z372 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示在低场区有吲哚环的特征信号δH7.00 (1H, s,H-2)，7.49 (1H, d,J=8.0 Hz, H-4)，7.02 (1H, t,J=7.6 Hz,H-5)，7.05 (1H, t,J=7.6 Hz, H-6)，7.32 (1H, d,J=8.0 Hz,H-7)；4 个活泼氢质子信号δH10.89 (1H, d,J=2.6 Hz,NH-1)，7.83 (1H, d,J=3.0 Hz, NH-10)，7.62 (1H, d,J=3.0 Hz, NH-13)，9.20 (1H, s, OH-19)；4 个芳香质子信号δH6.53 (2H, d,J=8.4 Hz, H-17, H-21)，6.59(2H, d,J=8.4 Hz, H-18, H-20)，提示分子中有1 个对位二取代的苯环；在高场区有两组亚甲基质子信号δH2.80 (1H, dd,J=14.5, 4.5 Hz, H-8)，2.43 (1H,ov, H-8)，δH1.83 (1H, dd,J=13.4, 6.9 Hz, H-15)，2.47(1H, ov, H-15)，两个次甲基质子信号δH4.01 (1H,m, H-9)，3.95 (1H, m, H-12)。13C-NMR (150 MHz,DMSO)结合DEPT 谱表明其有20 个碳信号，2 个酮羰基碳δC166.7，166.2，14 个芳香碳，2 个亚甲基碳δC30.0，40.0 和2 个次甲基碳δC55.9，55.2。对其碳信号进行归属：δC118.7 (C-2)、108.9 (C-3)、127.5 (C-3a)、118.4 (C-4)、120.8 (C-5)、124.3 (C-6)、111.3 (C-7)、136.0 (C-7a)、30.0 (C-8)、55.9 (C-9)、166.7 (C-11)、55.2 (C-12)、166.2 (C-14)、40.1(C-15)、126.4 (C-16)、130.7 (C-17, C-21)、114.9 (C-18, C-20)、156.0 (C-19)。以上数据与文献[7]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Tyr-L-Trp)。

化合物2：淡黄色固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z274 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)发现其与化合物1 一样有吲哚环的特征信号δH7.09 (1H, s, H-2)，7.52 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-4)，6.99(1H, t,J= 7.8 Hz, H-5)，7.02 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-6)，7.30 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-7)；3 个活泼氨基质子信号δH10.87 (1H, s, NH-1)，δH8.30 (1H, m, NH-10)，7.85 (1H, d,J= 2.9 Hz, NH-13)；两组亚甲基质子信号δH3.21 (1H, m, H-8)，3.13 (1H, m, H-8)，δH3.65 (1H, m, H-15)，3.05 (1H, m, H-15)，两个次甲基质 子 信 号δH4.87 (1H, m, H-9)，4.00 (1H, m, H-12)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT 谱表明其有14 个碳信号，2 个酮羰基碳δC167.2，165.7，8 个芳香碳，2 个亚甲基碳δC63.0，30.3 和2 个次甲基碳δC57.3，55.5。对其碳信号进行归属：δC127.6(C-2)、111.2 (C-3)、136.0 (C-3a)、118.6 (C-4)、120.8(C-5)、124.0 (C-6)、118.3 (C-7)、109.0 (C-7a)、30.3(C-8)、57.3 (C-9)、167.2 (C-11)、55.5 (C-12)、165.7(C-14)、63.0 (C-15)。以上数据与文献[8]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Trp-L-Ser)。

化合物3：白色固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z261 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)提示有2 个活泼氢质子信号δH7.87 (1H, s, NH-8)，9.22 (1H, s, OH-4’)；1 组对位二取代的苯环芳香质子信号δH7.04 (2H, d,J= 8.2 Hz, H-2’, H-6’)，6.63(2H, d,J= 8.2 Hz, H-3’, H-5’)；2 个次甲基质子信号δH4.24 (1H, t,J= 8.2 Hz, H-6)，4.03 (1H, dd,J=9.9, 2.9 Hz, H-9)；4 组亚甲基质子信号δH3.42 (1H,m, H-3)，3.24 (1H, m, H-3)，1.73 (2H, m, H2-4)，2.00(1H, m, H-5)，1.41 (1H, m, H-5)，2.93 (2H, m, H2-10)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT 谱表明其有14 个碳信号，2 个酮羰基碳δC168.9，165.1，6 个芳香碳，2 个次甲基碳δC58.4，56.0 以及4 个亚甲基碳δC44.6，34.7，27.8，21.9。对其碳信号进行归属：δC165.1 (C-1)、44.6 (C-3)、21.9 (C-4)、27.8(C-5)、58.4 (C-6)、168.9 (C-7)、56.0 (C-9)、34.7 (C-10)、127.0 (C-1’)、130.8 (C-2’, C-6’)、114.8 (C-3’,C-5’)、155.9 (C-4’)。以上数据与文献[9]对比基本一致，故确定为cyclo-(D-Tyr-D-Pro)。

化合物4：白色固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z311 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示3 个活泼氢质子信号δH9.30 (1H, s, OH-11)，7.84 (2H, t,J= 2.9 Hz, NH-1, NH-4)；9 个芳香区质子信号：4 个归为1 组对位二取代苯环δH6.85 (2H,d,J= 8.5 Hz, H-9, H-13)，6.65 (2H, t,J= 8.5 Hz, H-10, H-12)，5 个归为1 组单取代苯环δH7.20 (1H, t,J= 7.6 Hz, H-18)，7.04 (2H, d,J= 6.9 Hz, H-16, H-20)，7.28 (2H, t,J= 7.6 Hz, H-17, H-19)；2 组亚甲基质子信号δH2.58 (1H, dd,J= 13.6, 5.0 Hz, H-7)，2.20 (1H, d,J= 6.5 Hz, H-7)，2.19 (2H, dd,J= 13.6,6.5 Hz, H2-14)，2 个次甲基质子信号δH3.95 (1H, m,H-3)，3.90 (1H, m, H-6)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT 谱显示其有18 个碳信号，2 个酮羰基碳δC166.2，166.2，12 个芳香碳，2 个亚甲基碳δC40.1，38.5 和2 个次甲基碳δC55.7，55.4。对其碳信号进行归属：δC166.2 (C-2)、55.7 (C-3)、166.3 (C-5)、55.4 (C-6)、40.1 (C-7)、126.5 (C-8)、130.8 (C-9,C-13)、115.0 (C-10, C-12)、156.1 (C-11)、38.5 (C-14)、136.7 (C-15)、129.7 (C-16, C-20)、128.2 (C-17,C-19)、126.4 (C-18)。以上数据与文献[10]对比基本一致，故确定为cyclo-(L-Tyr-L-Phe)。

化合物5：白色固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z277 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示3 个活泼氢质子信号δH9.22 (1H, s, OH-4’)，8.02 (2H, dd,J= 5.6, 2.5 Hz, NH-1, NH-4)；4 个芳香质子信号δH6.90 (2H, d,J= 8.2 Hz, H-2’, H-6’)，6.64 (2H, d,J= 8.2 Hz, H-3’, H-5’)，提示分子中有1 个对位二取代苯环；3 个次甲基质子信号δH4.06(1H, q,J= 3.3 Hz, H-3)，3.44 (1H, m, H-6)，1.43 (1H,ov, H-8)，2 个亚甲基质子信号δH1.43 (1H, m, H-7)，1.23 (1H, m, H-7)，2.69 (1H, q,J= 13.6, 4.8 Hz,H-11)，3.01 (1H, q,J= 13.7, 3.7 Hz, H-11)以及2 个末端甲基质子信号δH0.63 (6H, ov, H3-9, H3-10)。13C-NMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT 谱显示其有15 个碳信号，2 个酮羰基碳δC166.2，167.4，6 个芳香碳，2 个亚甲基碳δC43.7，37.7，3 个次甲基碳δC55.7，52.3，21.4 以及2 个甲基碳δC22.9，22.8。对其碳信号进行归属：δC166.2 (C-2)、55.7 (C-3)、167.4 (C-5)、52.3 (C-6)、43.7 (C-7)、21.4 (C-8)、22.9(C-9)、22.8 (C-10)、37.7 (C-11)、125.8 (C-1’)、131.2(C-2’, C-6’)、114.8 (C-3’, C-5’)、156.4 (C-4’)。以上数据与文献[11]对比基本一致，故确定为cyclo-(LTyr-L-Leu)。

化合物6：白色固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z259 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示有2 个活泼氢质子信号δH5.05 (1H, d,J= 4.5 Hz,OH-4)和4.39 (1H, q,J= 4.0 Hz, OH-13)，3 个甲基质子信号δH0.88 (3H, d,J= 6.8 Hz, H3-12)，0.98(3H, s, H3-14)和δH1.05 (3H, s, H3-15)，5 对亚甲基质子信号δH2.14 (1H, m, H-3)，1.23 (1H, m, H-3)，1.74 (1H, m, H-9)，1.60 (1H, m, H-9)，1.44 (3H, m,H2-10, H-11)，1.32 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-11)，3.95(2H, m, H2-13)，3 个次甲基质子信号δH1.68 (1H,m, H-2)，4.57 (1H, m, H-4)，1.77(1H, m, H-8)。13CNMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT 谱共显示有15 个碳信号，包括4 个季碳δC52.1，150.1，136.7，39.8；3 个次甲基碳δC35.2，69.8，46.4；5 个亚甲基碳δC42.4，23.8，28.7，36.4，57.1 以及3 个甲基碳δC13.7，29.1，24.4。对其碳信号进行归属：δC52.1 (C-1)、35.2 (C-2)、42.4 (C-3)、68.9 (C-4)、150.1 (C-5)、136.7 (C-6)、39.8 (C-7)、46.4 (C-8)、23.8 (C-9)、28.7(C-10)、36.4 (C-11)、13.7 (C-12)、57.1 (C-13)、29.1(C-14)、24.4 (C-15)。以上数据与文献[12]对比基本一致，故确定为albaflavenol B。

化合物7：白色结晶固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z268 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)可看出其有13 个氢信号，包括5 个活泼氢质子信号δH3.56 (2H, m, NH2)，5.49 (1H, s, OH-5’)，5.36(1H, t,J= 4.9 Hz, OH-2’)和5.23 (1H, s, OH-3’)，4 个连氧次甲基质子信号δH4.56 (1H, s, H-2’)，4.14(1H, s, H-3’)，3.96 (1H, m, H-4’)和5.90 (1H, d,J=5.8 Hz, H-1’)，1 组亚甲基信号δH3.66 (2H, m, H2-5’)以及2 个低场区的烯氢质子信号δH8.37 (1H, s,H-8)和8.21 (1H, s, H-2)。13C-NMR (150 MHz,DMSO)显示其共有10 个碳信号，结合DEPT 谱可推测有3 个芳香季碳δC149.9，119.8，154.3，2 个连氮的芳香次甲基碳δC151.7，138.6，4 个次甲基碳δC87.8，73.5，70.5，85.7，1 个亚甲基碳δC61.5。对其碳信号进行归属：δC151.7 (C-2)、149.9 (C-4)、119.8 (C-5)、154.3 (C-6)、138.6 (C-8)、87.8 (C-1’)、73.5 (C-2’)、70.5 (C-3’)、85.7 (C-4’)、61.5 (C-5’)。以上数据与文献[13]对比基本吻合，故确定为βadenosine。

化合物8：绿色无定型固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z297 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,MeOD)显示有12 个氢信号，包括1 个活泼氢质子信号δH8.37 (1H, s, H-11)，1 个甲氧基质子信号δH3.79 (3H, s)，1 个甲基质子信号δH1.25 (3H, d,J=6.4 Hz, H3-13)，3 个低场区的芳香氢质子信号δH8.31 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-4)，6.92 (1H, t,J= 8.0 Hz,H-5)和7.65 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6)，以及2 个次甲基质子信号δH4.74 (1H, d,J= 3.2 Hz, H-8)和4.40(1H, m, H-12)，后与文献[14]对比发现其有4 个活泼氢质子信号没有显示出来，而根据相关化学位移可确定其是同一个已知化合物。13C-NMR (150 MHz, MeOD)显示有13 个碳信号，结合DEPT 谱可推测有6 个芳香碳δC123.4，119.4，126.2，128.2，152.5，115.6，2 个 羰 基 碳δC171.8，172.4，而δC162.1 为醛基碳，2 个次甲基碳δC59.4，68.4，1 个甲基碳δC20.5，以及1 个甲氧基碳δC52.9。对其碳信号进行归属：δC115.6 (C-1)、152.5 (C-2)、128.2(C-3)、126.2 (C-4)、119.4 (C-5)、123.4 (C-6)、171.8(C-7)、59.4 (C-8)、172.4 (C-9)、52.9 (C-10)、162.1(C-11)、68.4 (C-12)、20.5 (C-13)。以上数据与文献[14]对比基本吻合，故确定为N-formylantimyic acid methyl ester。

化合物9：白色粉末状固体，ESI-MS 显示准分子离子峰m/z499 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO)显示有19 个氢信号：δH8.20 (1H, s, H-11)，6.82(1H, s, H-10)，6.32 (1H, dd,J= 10.5, 1.3 Hz, H-3)，5.01 (1H, m, H-7)，2.99 (1H, dd,J= 2.5, 15.8 Hz, H-8)，2.80 (1H, dd,J= 10.3, 15.6 Hz, H-8)，2.58 (1H,m, H-4)，1.66 (1H, m, H-5)，1.65 (3H, s, 2-Me)，1.27(1H, m, H-6)，1.25 (1H, m, H-5)，1.06 (3H, d,J= 6.5 Hz, 4-Me)和0.95 (3H, d,J= 5.9 Hz, 6-Me)。而13CNMR (150 MHz, DMSO)结合DEPT 谱显示只有14 个碳信号：δC166.0 (C-1)，126.8 (C-2)，147.4 (C-3)，30.7 (C-4)，37.6 (C-5)，35.1 (C-6)，74.5 (C-7)，24.0 (C-8)，149.4 (C-9)，122.9 (C-10)，151.3 (C-11)，12.7 (2-Me)，21.1 (4-Me)和16.2 (6-Me)，说明这个化合物可能是一个具有对称结构的二聚体，通过与文献[15]中化合物conglobatin A 对比后发现两者波谱数据完全吻合，故最终确定为conglobatin A。

3 讨论

自上世纪发现青霉素以来，微生物中活性次生代谢产物一直是药物先导化合物的重要来源之一，据统计1940 年—2019 年间，科学家从微生物中开发出293 种治疗不同疾病的临床药物[16]。但随着研究的深入，很多微生物及其次生代谢产物存在被重复开发和提取分离的问题，加之多重耐药性的产生，迫使人们需要开拓新的制造药物的微生物来源[5-6]，而其中极地微生物资源是珍贵而特殊的。来自极地海洋等特殊生态环境的生物往往具有比陆地生物更为丰富的代谢途径和功能基因簇，增加了产生结构新颖且功能独特的次生代谢物的可能性。极地生物以微生物和一些能适应极端条件的海洋生物为主，然而与已报道的大量极地微生物相比，鲜有微生物活性天然产物相关研究报道，因此，极地微生物极具研究价值[17-18]。

笔者以一株采自北极海域海绵共附生放线菌Streptomycessp. LHW11-07 为研究对象，从其发酵浸膏中分离得到9 个单体化合物1～9，包括环二肽化合物1～5，倍半萜化合物6，核苷类化合物7，以及两个其他结构类型化合物8和9，其中化合物1和2是首次分离于Streptomyces放线菌，而这些化合物的生物活性还有待进一步探究；本研究进一步丰富了该属放线菌的化学多样性，同时，为高值化开发利用极地微生物这一国家战略资源提供了物质基础和理论依据。

据文献报道，化合物1对所测试的病原性细菌和真菌均具有一定的对抗作用[19]，化合物2测试了4 种肿瘤细胞均无明显的细胞毒性[20]，化合物3对海胆Strongylocentrotus intermedius胚胎具有细胞毒活性[9]，化合物5具有抗炎活性并对H1N1和RSV 病毒有一定的杀伤作用[21]，化合物7作为一种内源性嘌呤核苷，具有降低血压、抑制血小板聚焦、舒张血管、减慢心律等生理活性[22]，而化合物9可抑制癌细胞株的增殖，在体外对Trypanosoma bruceibruceiGUTat 3.1 表现出抗锥虫体活性等[23]。