响应盐胁迫调控的露地菊miR398a的克隆及功能研究

2022-12-06岳莉然刘颖婕刘晨旭周蕴薇

植物研究 2022年6期

岳莉然刘颖婕刘晨旭周蕴薇

（1. 东北林业大学，哈尔滨 150040；2. 德州职业技术学院，德州 253000；3. 吉林农业大学，长春 130118）

植物microRNAs 是一类长度为20～24 nt 的非编码小RNA，能控制mRNA 降解或抑制其翻译，通常在转录后水平负调节基因表达来发挥作用［1］。miRNA 控制了多种生物和代谢途径中众多基因的表达，在植物生长发育和应对非生物胁迫中扮演着重要角色，尤其在植物响应盐胁迫的过程中起着关键作用［2］。例如：miR164 通过靶向NAC转录因子使其增加侧根数量来平衡植物对水分的吸收［3］；miR393 通过提高种子萌发时的激素含量，从而提高种子的耐盐性［4］；拟南芥（Arabidopsis thali⁃ana）中的miR171 和miR396 能够通过改变植株形态来抵御盐胁迫［5］；过量表达osa-miR319a 能够增加水稻（Oryza sativa）的耐盐性［6］；在高盐胁迫下，玉米（Zea mays）中上调表达的miR159 调控ABA信号调节过程，进而抵抗盐胁迫［7］。

miR398 是一类多数为21 nt 组成的miRNA［8］，在拟南芥中miR398 家族包括-a、-b 和-c 3 类成员［9］。miR398 作为一种保守的miRNA 广泛存在于植物中，并在非生物胁迫中扮演着重要的角色［10］。在盐胁迫下，miR398 在拟南芥［11］、烟草（Ni⁃cotiana tabacum）［12］、番茄（Lycopersicon esculen⁃tum）［13］等植物中均显著下调表达；热胁迫和SO2都能诱导miR398a 表达量降低［14-15］。miR398 通过降低靶基因的表达量来抵御活性氧的毒害，进而增强植物抵抗逆境胁迫的能力［16］。在拟南芥中，miR398 能通过剪切靶基因CSD转录出的mRNA降低植株耐热性［14］；在臭氧、盐害等非生物胁迫下，拟南芥能够抑制miR398 的表达进而上调相应靶基因使其抵抗胁迫［17］；miR398 与CSD的结合还可以控制生物体内铜元素水平的自我平衡［18］。

露地菊（Chrysanthemum×grandiflora）是在引种地被菊的基础上，经过天然杂交、卫星搭载后选育的一个新的地栽小菊品种群［19］，因其抗性强、易管理、花繁茂等特点成为了秋季景观营造中非常重要的一类植物材料。本课题组前期通过对盐胁迫前后的露地菊‘纽9717’miRNAs 进行高通量测序，发现露地菊miR398 家族成员miR398a 呈现显著差异表达。为探究露地菊miR398a 在非生物胁迫过程中的功能和作用机制，本研究对miR398a前体和靶基因进行分析，克隆miR398a 前体并构建植物表达载体，获得过表达cgr-MIR398a 转基因拟南芥并对其进行功能验证。这为miR398a 在露地菊的表达特性及功能的研究奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用东北林业大学园林学院组培室培养的露地菊‘纽9717’植株，移栽后用60 mL 的200 mmol·L-1NaC1 溶液进行浇灌，以浇灌蒸馏水的植株为对照，处理12 h，用于检测基因的表达量变化。拟南芥为哥伦比亚野生型。

1.2 试剂

DNA 提取试剂盒、cDNA 反转录试剂盒和pMD18-T 载体购自TOYOBO 公司，DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自OMEGA公司，大肠杆菌DH5α 购自维地生物公司，pBI121 MCS-GFP 载体、限制性内切酶和根瘤农杆菌为东北林业大学园林学院实验室保存。

1.3 试验方法

1.3.1 miRNA前体序列的扩增

以露地菊叶片为试验材料，从课题组前期测序所得露地菊sRNA 数据库中得到该miRNA 的前体cgr-MIR398a 序列及成熟体cgr-miR398a 序列。通过Premier 5.0 设计引物cgr-MIR398a-F、cgr-MIR398a-R（见表1），以露地菊叶片DNA 为模板进行PCR 并与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞，送生物公司测序。

表1 PCR引物碱基序列Table 1 List of PCR primer sequences

1.3.2 生物信息学分析

利用在线软件RNAfoldWebSever（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）进行miRNA 前体二级结构的预测，WebLOGO（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）对miRNA 成熟序列的碱基保守性进行分析。从公共数据库miRBase（22.1 版）（http：//www.mirbase.org/）下载已登录的所有植物的miR398a 成熟序列及前体序列，用MEGA 6.0 软件Neighbor-Joining 法构建基于miRNA 前体的系统进化树。

1.3.3 靶基因预测

利用课题组前期测序所得露地菊降解组数据库原始数据，使用CleaveLand 4.0 程序［20］和AC⁃GT301-DGEv1.0程序（联川生物）预测cgr-MIR398a靶基因。根据植物miRNA/靶标配对标准［21］，对列阵进行评分，绘制T-plot图。

1.3.4 实时荧光定量分析

采用RNA 试剂盒提取长势良好的露地菊叶、根和拟南芥叶片的总RNA，使用miRNA 反转录试剂盒（TaKaRa）进行反转录，利用miR398a 的成熟体cgr-miR398a-F 和试剂盒通用下游引物为上下游引物，以U6为内参基因（见表1）进行荧光定量试验。参照cDNA 反转录试剂盒，用NCBI 在线工具Primer-BLAST 设计靶基因的上下游引物，以CmEF1a基因［22］作为内参（见表1）进行荧光定量实验，所有试样重复3 次。蒸馏水作为对照，每个处理3 个生物学重复。参照2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ，擎科）说明书，采用2-∆∆CT方法分析基因的相对表达量。

1.3.5 植物表达载体的构建和拟南芥的转化筛选

使用基因特异性引物cgr-MIR398aM-F 和cgr-MIR398aM-R 进行PCR 扩增，使用KpnⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切，过夜转化，挑取单菌落扩大培养，送公司测序。将鉴定正确的重组载体pBI121-cgr-MIR398a-GFP 转入农杆菌。利用浸花法转化拟南芥，收获种子后用含50 mg·L-1Kana 的1/2 MS 培养基逐代筛选，直至获得cgr-MIR398a 过表达拟南芥纯合体植株。以pBI121载体的上下游引物PBI121-GFP-F 和PBI121-GFP-R（见表1）进行PCR验证，并对cgr-miR398a的表达量进行检测。

1.3.6 cgr-MIR398a 转基因拟南芥响应盐胁迫的表型及生理检测

将拟南芥野生型和T3 代纯合转基因种子消毒后，分别种于含0、75、100、150 mmol·L-1NaCl 的MS固体培养基中，冰箱内4 ℃春化3 d后置于植物培养箱中培养，以胚根伸出种皮作为发芽标准，计算培养7 d的发芽率。

将拟南芥野生型和T3 代纯合转基因种子消毒后接种于MS 固体培养基，冰箱内4 ℃春化3 d后置于植物培养箱中培养，长出2 片真叶后上盆，正常生长4 周后进行胁迫，处理组植株每2 d 浇灌200 mmol·L-1NaCl 溶液50 mL，对照组浇灌等量清水，取胁迫9 d 的拟南芥植株测定超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性［23］、过氧化氢含量（分光法，苏州科铭）和超氧阴离子含量（分光法，苏州科铭）。进行3 次生物学重复，使用GraphPad prism 8.0进行多重分析。

2 结果与分析

2.1 露地菊miR398a前体克隆

以露地菊叶片DNA 为模板，使用前体序列cgr-MIR398a 上下游引物进行PCR 扩增，产物经电泳检测，结果表明在200 bp 左右的位置有一条特异性条带（见图1）。DNA 测序结果与预测所得露地菊miR398a前体序列一致。

图1 露地菊miR398a前体PCR扩增结果M.DL2000；1.cgr-MIR398aFig.1 PCR result of cgr-MIR398a in Chrysanthemum×grandiflora M.DL2000；1.cgr-MIR398a

2.2 植物miR398a前体的进化特性

对已知的22个物种及露地菊的miR398a前体序列构建进化树。裸子植物挪威云杉（Picea excel⁃sa）与双子叶植物甜橙（Citrus sinensis）聚集于同一分支，单子叶植物水稻和玉米分别与不同的双子叶植物聚成分支，这说明MIR398a 的进化特性与现有的植物形态学分类并不完全一致。露地菊cgr-MIR398a 与毛茛科的耧斗菜（Aquilegia coeru⁃lea）aqc-MIR398a 的相似度较高（见图2）。推测露地菊miR398a的进化特性与耧斗菜接近。

图2 基于miR398a前体序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of pre-miR398a

2.3 露地菊miR398a 前体二级结构预测及成熟序列保守性分析

利用RNAfold WebSever 对露地菊miR398a 前体序列进行二级结构预测，结果表明露地菊miR398a前体能形成典型的发卡结构，序列的结构最小自由能dG 值为-196.39 kJ·mol-1。其中miR398a的成熟体序列在茎部结构的5′端和3′端，且在最后一个碱基位置其保守性最低（见图3）。对已知miR398a成熟序列的碱基保守性进行分析，结果表明植物miR398a-3p端的成熟序列的碱基保守性较强且整体高于5p 端，miR398a-5p 只在第1、2、6 和13 位的碱基保守性较强且都偏好鸟嘌呤（G）（见图4）。

图3 露地菊miR398a前体二级结构及前体保守性示意图A.红色红框内为cgr-miR398a 的成熟体序列；B.不同颜色代表其保守性程度，红色表示保守程度最高，蓝色表示保守程度最低Fig.3 The pre-miR398a sequences and the conserved nucleotide sequence of pre-miR395a in Chrysanthemum×grandiflora A.Mature miR395a sequence is showed with the red square；B.Differ⁃ent colors represent the conservative degrees，and the red is the most conservative，the blue is the lest conservative

图4 miR398a-3p和miR398a-5p成熟序列碱基保守性A.miR398a-3p；B.miR398a-5pFig.4 Conservative analysis of nucleotides in miR398a-3p and miR398a-5p A.miR398a-3p；B.miR398a-5p

2.4 露地菊miR398a靶基因预测

利用露地菊根和叶降解组测序数据进行miR398a靶基因预测，结果表明在露地菊根和叶中共预测得到18 个靶基因，其中叶中有11 个靶基因，根中有12 个靶基因。有5 个靶基因在根和叶中被共同靶向，包括硫醇酶基因、铜-锌超氧化物歧化酶基因和铜伴侣蛋白基因等。在叶中单独检测到的靶基因有叶绿体酶2 基因、DNAJ 热激蛋白家族基因等；在根中被单独靶向的基因包括含有糖苷水解酶，含催化域蛋白、PH、RCC1和FYVE结构域的蛋白质1样异构体X3等（见表2）。miR398a在叶和根中的靶基因不完全一致，表明miR398a在植物不同组织中行使的功能存在差异。

表2 露地菊miR398a靶基因预测Table 2 Target genes of cgr-miR398a of Chrysanthemum×grandiflora

2.5 露地菊在盐胁迫下miR398a 及靶基因在根和叶中的相对表达量

盐胁迫下，露地菊miR398a-3p 在根和叶中都显著下调，而叶中miR398a-5p 表达量在盐处理前后没有显著变化，但在根中变化显著（见图5：A～B）。选取罚分较低且T-plot 峰值较单一的靶基因（CSD2、CCS、SAP8）验证其盐胁迫前后的相对表达量。结果表明，CSD2、CCS、SAP8在盐胁迫下，在根和叶中都有不同程度的上调（见图5：C～E）。

图5 在盐处理下露地菊的根和叶miR398a和靶基因的相对表达量A.miR398a-3p；B.miR398a-5p；C.CSD2（TRINITY_DN123102_c0_g2）；D.CCS（TRINITY_DN96068_c0_g2）；E.SAP8（TRINITY_DN94774_c3_g5）Fig.5 Relative expression levels of miR398a and target genes in leaf and root of Chrysanthemum×grandiflora under salt stress A.miR398a-3p；B.miR398a-5p；C.CSD2（TRINITY_DN123102_c0_g2）；D.CCS（TRINITY_DN96068_c0_g2）；E.SAP8（TRINITY_DN94774_c3_g5）

2.6 露地菊miR398a 植物表达载体的构建和农杆菌的转化

使用基因特异性引物扩增cgr-MIR398a，回收并连接至pMD18-T，将测序正确的质粒命名为pMD18-T-cgr-MIR398a。用KpnⅠ和SalⅠ限制性内切酶，对pMD18-T-cgr-MIR398a 质粒和pBI121 MCS-GFP（启动子为35 S）空载体质粒分别双酶切后，用T4 连接酶连接获得重组质粒，命名为pBI121-cgr-MIR398a-GFP。双酶切检测结果表明重组质粒被切开，目的片段长度在220 bp 左右（见图6A）。将重组质粒电转至农杆菌感受态细胞中，进行PCR 验证，目的条带符合通用引物长度，说明重组质粒已成功转入农杆菌中（见图6B）。

图6 pBI121-cgr-MIR398a-GFP双酶切鉴定（A）和农杆菌重组菌落PCR鉴定（B）M.DL2000 DNA Marker；0.pBI121-cgr-MIR398a-GFP；1.阴性对照；2、4～10.单菌落Fig.6 Double digestion of pBI121-cgr-MIR398a-GFP（A）and PCR identification of agrobacterium recombinant plas⁃mid（sB）M.DL2000 DNA Marker；0.pBI121-cgr-MIR398a-GFP；1.Negative control；2，4-10.Single colony

2.7 转cgr-MIR398a 基因拟南芥植株的鉴定及表达分析

经Kana 抗性培养基筛选，转基因阳性植株叶片为绿色且生长良好（见图7A）。PCR鉴定结果表明已成功转入外源cgr-MIR398a（见图7B）。对成熟cgr-miR398a 进行实时定量PCR 分析表明，cgr-MIR398a在转基因拟南芥叶片中表达量显著高于野生型。说明整合到拟南芥基因组中cgr-MIR398a经剪切可以加工成为成熟的cgr-miR398a（见图8A），转基因拟南芥中At2g28190（CSD2）和At1g12520（CCS）的相对表达量低于野生型（见图8B）。

图7 过表达cgr-MIR398a拟南芥抗性筛选（A）与PCR验证（B）M.DL2000 DNA marker；1.重组质粒；2.野生型拟南芥；3.阴性对照；4～10.转基因植株Fig.7 Resistance screening（A）and PCR verification（B）of Arabidopsis thaliana overexpressing cgr-MIR398a M.DL2000 DNA marker；1.Recombinant plasmid；2.Wild-type Arabidopsis；3.Negative control；4-10.Transformed plant

图8 转基因拟南芥miR398a及靶基因的表达水平WT.野生型；1～7，OE.转基因株系；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.01；下同Fig.8 Expression analysis of miR398a and target genes in transgenic Arabidopsis WT.Control；1-7，OE.Transgenic Arabidopsis；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.01；The same as below

2.8 过表达cgr-MIR398a 转基因拟南芥对盐胁迫的响应

2.8.1 盐胁迫对过表达cgr-MIR398a 转基因拟南芥种子萌发过程的影响

选取表达量高的3 个转基因株系分别命名为OE-1、OE-2、OE-3，对其进行表型和生理实验。结果表明，不含NaCl 的MS 培养基中，野生型WT 和转基因拟南芥种子的发芽率均为100%；随着盐浓度增加，种子发芽率呈现逐渐降低的趋势。100 mmol·L-1NaCl 处理下，OE-1、OE-2、OE-3 的发芽率与WT 相比均下降；150 mmol·L-1NaCl 处理时，WT的发芽率依旧能维持60%左右，而转cgr-MIR398a基因南芥发芽率仅为15%左右（见图9）。

图9 过表达cgr-MIR398a拟南芥在不同盐浓度处理下的发芽率WT.野生型株形；OE-1/2/3.转基因株系；下同Fig.9 Germination rates of Arabidopsis overexpressing cgr-MIR398a under different salt concentrations WT.Control；OE-1/2/3.Transgenic Arabidopsis；The same as below

2.8.2 盐胁迫对过表达cgr-MIR398a 转基因拟南芥表型的影响

对生长状况一致的拟南芥野生型和转基因植株进行盐胁迫处理。胁迫6 d 时野生型和转基因植株生长良好、叶片颜色鲜绿；胁迫9 d 时野生型叶片边缘轻微枯黄，转基因叶片变软并出现失水现象；胁迫12 d 时野生型叶片开始失水萎蔫，而转基因植株已经出现单株死亡现象（见图10）。因此，盐胁迫处理时转基因株系受盐害程度显著高于野生型。

图10 过表达cgr-MIR398a拟南芥在200 mmol·L-1 NaCl处理下的形态特征Fig.10 Morphological characteristics of Arabidopsis overexpressing cgr-MIR398a under 200 mmol·L-1 NaCl treatment

2.8.3 过表达cgr-MIR398a 转基因拟南芥盐胁迫后的生理指标检测

对生长状况一致的拟南芥野生型和转基因植株进行盐胁迫，9 d 后检测SOD、POD 酶活性和超氧阴离子（OFR）、过氧化氢（H2O2）含量。结果表明，胁迫后野生型和转基因拟南芥的SOD、POD 活性均增加，且野生型SOD、POD 活性均显著高于转基因拟南芥，（见图11：A～B）。OFR 和H2O2含量测定结果表明，在胁迫处理后，转基因拟南芥的OFR和H2O2含量均增加且高于野生型（见图11：C～D）。

图11 转基因拟南芥盐胁迫后的生理指标检测Fig.11 Physiological indicators of transgenic Arabidopsis thaliana under salt stress

3 讨论

miRNA 普遍存在于植物体中，主要通过剪切靶基因或抑制靶基因蛋白翻译，对植物的生长发育、胁迫响应和信号转导等重要生理过程进行调控［24-25］。本研究对植物miR398a 成熟体序列进化分析得出miR398a 广泛存在于植物中且高度保守。露地菊miR398a 虽有少量碱基差异，但并不影响前体二级结构的形成，且miR398a 在进化过程中并没有改变其在CSD的mRNA 上的靶点［11］，因此在非生物胁迫下cgr-miR398 具有与其他植物相似的调节作用。qRT-PCR 结果表明在盐胁迫下，露地菊的根和叶中miR398a 表达水平存在差异，可能是应对胁迫时植株不同部位表现出不同程度的响应［26］。相同组织部位下，露地菊miR398a的3′端和5′端的表达也存在差异，这与对紫花苜蓿（Medicago sativa）的研究结果［27］一致。有研究发现在RISC成熟过程中双链miRNA/miRNA*双链伴随Argonaute（AGO）蛋白，其中一条链被催化去除，另一条与靶点结合并引导沉默［28］。推测叶中miR398a-5p 的表达量在盐胁迫前后没有显著改变可能因为miR398a-5p 在叶中裂解，发挥作用的是miR398a-3p。

抵抗盐胁迫时，miRNA 的功能主要通过对靶基因的调控实现。通过降解组测序得到的miR398a 的靶基因有叶绿体中的铜/锌超氧化物歧化酶基因（CSD2）、铜伴侣蛋白基因（CCS）。拟南芥的miR398 能够通过靶向CSD2来清除活性氧、保护细胞膜结构，从而抵抗盐害［29］。而CCS 能够传递铜离子到CSD 中，影响CSD的表达［28］。推测露地菊miR398a 可能通过相同的途径响应胁迫。qRT-PCR 验证了露地菊的根和叶中CSD2和CCS在盐胁迫12 h 后上调。此外，靶基因还预测到了A20/AN1-l 锌指家族蛋白（SAP）基因。SAP基因涉及胁迫应答，能参与种子萌发和抵御多种非生物胁迫［30-31］。在盐胁迫下SAP8也上调表达，但二者匹配度相对其他成员较差，因此二者是否真的是稳定的miRNA-靶基因匹配关系仍待后续研究。

盐胁迫下，野生型拟南芥发芽率和生长情况均优于cgr-miR398a 转基因植株。200 mmol·L-1NaCl胁迫12 d后，野生型拟南芥失水萎蔫，而转基因拟南芥叶片处于半枯黄状态且出现单株死亡现象。ORF 和H2O2是可以造成氧毒害的活性氧（ROS），具有强氧化性，其含量过高会损伤细胞膜结构，降低植物抵御逆境胁迫的能力［32］。抗氧化酶SOD 和POD 能有效清除ROS，在植物应对非生物胁迫时发挥着关键作用［33-34］。胁迫后，转基因植株的OFR 和H2O2积累显著高于野生型，SOD 和POD的活性却显著低于野生型，说明过表达的cgr-MIR398a 可能通过靶向CSD从而降低靶基因的表达，进而降低植物清除ROS的能力，使植株收到的盐胁迫损伤加重。综上，cgr-miR398a 在拟南芥的幼苗期和成苗期均减弱了植物的耐盐能力，且在拟南芥响应盐胁迫中起着负调控作用。