中老年白癜风患者皮损组织差异表达基因筛选及生物信息学

张静 邢卫斌 王琳

(天津市第五中心医院皮肤科，天津 300450)

白癜风是一种后天性色素脱失性疾病，遗传背景的基础上免疫因素发挥了重要作用。全基因组扫描技术发现白癜风患者有超过50个易感基因位点〔1～3〕，并且有家族史的白癜风患者更容易发展为严重临床类型〔4，5〕。中老年患者发病率相对较低，发病机制研究自然较少。本次研究利用基因表达综合数据库(GEO)数据库纳入的中老年白癜风患者数据信息，全面分析其皮损组织和自身正常皮肤组织基因表达谱差异，筛选可能的关键致病基因，旨在为进一步阐明中老年患者白癜风发病的遗传学机制提供线索。

1 材料和方法

1.1数据来源 30例样本均来自15例患者的皮损与自身正常皮肤组织，患者年龄均在40～65岁，病程1个月至3年。基因表达谱数据来源于GEO数据库，基于GPL6884平台Illumina HumanWG-6 v3.0 expression beadchip芯片。

1.2差异表达基因筛选 根据GPL6884平台探针的信息注释相应的基因，利用R(version4.0.1)的scale函数对基因的表达矩阵进行归一化处理，然后使用limma包分析差异表达基因，BH方法对统计P值进行矫正，选取log2|Fold Change(FC)|>1.5及校正后PBH<0.05 作为差异表达基因的阈值。

1.3功能富集分析 利用toppgene在线工具对差异表达基因进行通路富集分析，PBH<0.05为阈值筛选显著富集的京都基因与基因组数据库(KEGG)和反应通路和生物学过程数据库(Reactome)生物学通路。利用R包cluster Profiler(version3.8.1)对差异表达基因进行GO富集分析，PBH<0.05为阈值筛选显著富集的生物学过程(BP)、细胞组分(CC)及分子功能(MF)。

1.4基因互作网络分析 利用STRING数据库对差异表达基因建立相互作用网络。

1.5所用到的数据库 GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；toppgene(https：//toppgene.cchmc.org/)；KEGG(www.genome.jp/kegg)；Reactome(https：//reactome.org)；基因本体论(GO，http：//www.geneontology.org/)；STRING(https：//string-db.org/)。

2 结 果

2.1差异表达基因 白癜风患者皮损组织与自身正常皮肤组织基因表达谱差异统计分析中筛选出了141个显著差异表达基因，其中122个基因表达上调，19个基因表达下调。位于4号染色体上的趋化因子CXC配体(CXCL)10上调差异表达最为显著，差异倍数log2FC=2.67，PBH<0.001。位于9号染色体上的酪氨酸相关蛋白(TYRP)1下调差异表达最为显著，差异倍数log2FC=-2.40，PBH<0.001。由于筛选出的差异基因较少，因此利用R包OmicCircos对log2|FC|>1，P值<0.05的1 011个基因的表达情况进行可视化见图1。图内共有5个轨道，从外向内，最外层轨道为染色体坐标，第二层轨道为基因的表达热图，第三层轨道为基因表达的PBH散点图，PBH值越小散点则越大，第四层轨道为基因表达的差异倍数(log2FC)的折线图，最内层轨道为差异表达基因的互作网络图。左侧部分对我们筛选出的关键基因CXCL10和TYRP1的表达情况进行突出显示。

图1 皮损组织与自身正常皮肤组织差异基因表达情况

2.2功能富集分析 利用PBH<0.05作为阈值筛选到了26条显著富集的GO条目(13条BP条目和13条CC条目，未筛选出显著的MF条目)。从结果可以看出大部分条目与基因的转录、翻译过程相关。见图2。不同的散点形状表示不同的GO类别，圆圈表示BP条目，三角形表示CC条目；散点的大小表示差异表达基因映射到该条目中基因的个数；颜色反映了富集的显著性，显著性越高，PBH值越小，颜色越红；横轴GeneRatio为映射到该条目的基因个数与该条目中基因总个数的比值。

图2 差异表达基因显著富集的GO BP、CC条目

2.3基因相互作用网络 将141个差异表达基因映射到STRING数据库的蛋白质互作网络中得到了

199条互作对(结果如图1最内层轨道所示)。其中对表达最为显著的差异基因CXCL10和TYRP1网络节点图单独显示(黄色标注，见图3)，可以看出两个基因通过多巴色素互变异构酶(DCT)和CD69相互联系，又分别和其他基因存在着错综复杂的关系，并且CXCL10相对处于比较核心地位。

TYR：酪氨酸酶；SOX10: 性别决定区盒基因-10；POU3F1: POU结构域第3类转录因子1；MLANA： 黑色素A；RGS1: 蛋白信号调节因子1；LEO1：paf1/RNA聚合酶Ⅱ复合物组分；IFIT1: 干扰素诱导的四肽重复蛋白1；IFI27：干扰素-α诱导蛋白27

2.4通路富集分析 利用PBH<0.05作为阈值筛选到了21条显著富集的生物学通路(18条Reac-tome通路和3条KEGG通路，见表1)，从结果可以看出大部分通路与基因的转录和翻译及氨基酸代谢相关。有部分基因参与了酪氨酸的代谢和黑素生成。

表1 差异表达基因显著富集的生物学通路

3 讨 论

白癜风患者有明显的家族遗传背景，有人对150例白癜风患者的家族发病情况进行调查发现，家族阳性史可占到26.0%，其中一级，二级，三级亲属共患率分别为14.6%，16.0%，4.7%，并表明遗传因素在非节段型的白癜风患者中具有更为明显倾向〔6，7〕。而自身免疫学说在遗传背景下发挥了重要的致病作用，文献研究证实中老年白癜风患者伴有自身免疫性甲状腺疾病、系统性红斑狼疮及类风湿关节炎等疾病的概率远高于一般人群，可能和细胞凋亡，免疫细胞异常活化及大量抗体的产生有关〔8，9〕。本次研究发现CXCL10基因显著上调表达，相关文献也证实了这一点〔10～12〕。CXCL10可由多种细胞分泌，如角质形成细胞，中性粒细胞及树突细胞。有研究发现黑素细胞本身在炎症因子刺激下也可分泌CXCL10〔13～15〕。白癜风皮损中存在大量促炎细胞及细胞毒性CD8+T细胞，CD8+T细胞被抗原刺激活化后分泌大量的干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子，这些细胞因子可诱导多种细胞分泌趋化因子，使T细胞由外周向皮损组织定向迁移。这些抗原可能是皮损中的黑素细胞，研究发现白癜风患者黑素细胞本身的抗氧化能力下降，易受活性氧(ROS)的损伤，细胞内过多的ROS聚集导致黑素细胞内DNA的损伤。同时白癜风患者角质形成细胞也存在氧化应激损伤，p38磷酸化等，不仅不能正常分泌维持黑素细胞生长的一些营养源。同时角质形成细胞的损伤也导致IFN-γ介导CXCL9/10-CXC趋化因子受体(CXCR)3轴异常激活，引起CXCL10在皮损中表达增加，血清亦是如此。CXCL10表达增加将进一步募集更多的CD8+T细胞迁移皮损介导黑素细胞的破坏〔16，19〕。研究发现经过治疗后的白癜风患者血清和皮损组织的CXCL10表达水平明显降低。所以趋化因子CXCL10不仅可以作为本病的一个治疗靶点，同时也可以作为疗效监测指标指导预后，甚至可以作为一个白癜风诊断的血清学指标，这些都有待后续研究进一步证实。黑素为一组单体吲哚分子通过共价键连接，并于醌和蛋白质高度聚合而形成的一种异质性聚合物。在黑素形成过程中，TYR、TYRP1及TYRP2等构成的酪氨酸相关蛋白(TRP)发挥着重要作用，同时这些蛋白也是黑素形成的物质基础。这些蛋白和基因同时受到小眼畸形相关转录因子(MITF)的转录调控，它们共同构成立体网络调控黑素细胞的发育，分化和功能〔20〕。白癜风是典型的黑素缺陷和(或)功能障碍性疾病，国内学者曾对20例寻常型白癜风患者皮损区域黑素细胞培养并进行免疫印迹发现在患者皮损中，TYRP1，TYRP2及MITF均出现一致性的下调表达〔21〕，这一点和本次研究结果是完全吻合的。说明TYRP1的显著下调，影响了黑素合成的质和量，从而出现了色素脱失性皮损。MITF的表达水平本研究未涉及，有文献表明在节段型的白癜风患者，两者表达水平并非一致，这些有待于后续研究进一步证实。

综上，白癜风是在遗传基因表达异常情况下引起黑素合成受限，黑素细胞受到破坏的疾病。利用关键因子作为靶点制备新的生物制剂有望开辟一个新的治疗前景。