miR-206靶向CXCR4对食管癌细胞增殖和迁移的影响

何松林 肖宗位 丁伟浩 高珂 山地普 毛龙 王文凭

(1成都市第二人民医院胸外科，四川 成都 610011；2四川大学华西医院胸外科)

食管癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界范围内的发病率和死亡率都位居前列，其中我国食管癌每年的新发病例占据世界新发病例的一半以上，死亡率则高居世界榜首〔1〕。多数食管癌患者在发现时就已进展到晚期，总体5年生存率只有20%左右〔2〕，因此，深入阐明食管癌的发病机制对其早期诊断、靶向治疗和预后评估具有重要意义。微小RNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长度18～23个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，成熟的miRNA通过与其靶基因的3′非翻译区以完全或不完全配对的方式，来降解其靶基因或抑制其转录后翻译，在细胞的发育、增殖、分化及凋亡中发挥着重要的调节作用〔3,4〕。miR-206位于人类第6号染色体，研究显示，miR-206可与信号转导及转录激活蛋白(STAT)3、肝细胞生长因子受体(MET)、肌动蛋白相关蛋白复合物(ARPC)3、血管内皮生长因子(VEGF)等多种细胞周期、分裂和凋亡调节相关基因结合，与肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤的侵袭和转移密切相关〔5,6〕。本研究旨在探究miR-206对食管癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制。

1 资料与方法

1.1细胞培养 人正常食管上皮细胞HEEC和人食管癌细胞株EC9706、TE-1、ECA109(美国ATCC细胞库)采用RPMI1640完全培养基(美国Gibco，含10%胎牛血清和100 U/ml青链霉素)培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。细胞培养至密度超过90%后用0.25%胰蛋白酶消化并传代。

1.2RT-PCR检测miR-206表达 收集对数期HEEC、EC9706、TE-1和ECA109细胞1×106个，采用RNA小量提取试剂盒和逆转录试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取细胞总RNA并逆转录为cDNA。根据miR-206和内参U6的核苷酸序列设计RT-PCR引物： miR-206-正义链：5′-GCTTCCCGAGGCCACATGC-3′，miR-206反义链：5′-CACTTGCCGAAACCACAC-3′；U6正义链：5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-反义链：5′-TATGGAACGCTTCACGAA-3′。根据RT-PCR试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific)说明书配制反应体系，在荧光定量PCR仪上设置反应程序为：95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。反应结束后采用2-ΔΔCt法分析miR-206的mRNA相对表达水平。

1.3miR-206过表达细胞系构建 对数期293T细胞胰酶消化后接种到6孔板，培养细胞密度至70%，分别将plent-GFP-NC慢病毒载体和plent-GFP-miR-206慢病毒过表达载体(山东维真生物科技有限公司)与包装质粒共转293T细胞，6 h后更换新鲜培养基。48 h和72 h后分别收集细胞培养上清并混合，0.22 μmol/L滤器过滤，测量病毒滴度。人食管癌细胞EC9706培养至对数生长期，胰酶消化后接种到6孔板，培养至细胞密度为70%。将收集的GFP-NC和GFP-miR-206慢病毒上清分别加入到EC9706细胞中。感染48 h后加入浓度为1 μg/ml的嘌呤霉素，持续筛选7 d直至荧光显微镜下所有细胞均表达绿色荧光。RT-PCR验证细胞miR-206表达水平以确认过表达细胞系构建成功，分别命名为GFP-NC组和GFP-miR-206组细胞。

1.4双荧光素酶报告基因实验 将野生型趋化因子受体(CXCR)4(CXCR4-WT)和缺失miR-206结合区域的突变体CXCR4(CXCR4-Mut)基因采用分子克隆方法分别构建到荧光素酶报告载体(山东维真生物科技有限公司)上。对数期的GFP-NC和GFP-miR-206细胞胰酶消化后接种到6孔板，培养至细胞密度70%时，分别转染CXCR4-WT和CXCR4-Mut荧光素酶报告载体。转染48 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天生物技术公司)检测各组细胞的相对荧光素酶活性。

1.5CCK-8细胞增殖检测 将野生型CXCR4采用分子克隆方法构建到pcDNA3真核表达载体，将pcDNA3-CXCR4过表达载体转染GFP-miR-206细胞系，即为GFP-miR-206/CXCR4-OE组。转染24 h后，胰酶消化GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE组细胞，并调整细胞密度至2×105个/ml。分别取100 μl GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE组细胞悬液接种到96孔板，并于接种后第24、48和72小时向各组细胞加入10 μl CCK-8溶液(碧云天生物技术公司)，继续孵育4 h。酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.6Transwell细胞迁移检测 对数期GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE组细胞胰酶消化，并重悬细胞密度至5×105个/ml，分别取100 μl细胞悬液接种到预铺基质胶的transwell上室(美国Corning公司)，下室加入500 μl完全培养基，继续培养24 h。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5 min。甲醇固定20 min后，棉签轻轻擦拭上室未迁移的细胞，1%结晶紫染色5 min，PBS洗涤3次。室温干燥后显微镜下随机选取5个视野观察细胞迁移情况。

1.7Western印迹 收集GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE组对数期细胞各1×106个，PBS洗1次，加入200 μl 细胞裂解液，4℃冰上裂解30 min。14 000 r/min离心15 min，取上清加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白上样缓冲液，沸水浴煮沸10 min。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜，5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h。加入封闭液稀释的CXCR4抗体(1∶1 000，英国Abcam)、EGFR抗体(1∶2 000，英国Abcam)和VEGF(1∶2 000，英国Abcam)，4℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗3次。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000，碧云天生物技术公司)，室温孵育2 h，PBST洗3次，蛋白凝胶成像仪显影。采用Quantity One凝胶分析软件分析蛋白相对表达水平。

1.8统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1miR-206表达水平比较 HEEC、EC9706、TE-1和ECA109细胞中miR-206的mRNA相对表达水平分别为1.72±0.13、0.36±0.04、0.51±0.06和0.40±0.04，与HEEC细胞比较，EC9706、TE-1和ECA109细胞中miR-206的mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。

2.2miR-206和CXCR4靶向关系验证 生物信息学分析显示miR-206可与CXCR4的3′-UTR区靶向结合，提示CXCR4可能是miR-206的下游靶向基因。荧光素酶报告基因实验结果表明，与GFP-NC细胞(1.85±0.15)比较，转染CXCR4-WT的GFP-miR-206细胞相对荧光素酶活性(0.31±0.04)下降，差异有统计学意义(P<0.05)；转染CXCR4-Mut的GFP-NC细胞(1.77±0.14)和GFP-miR-206细胞相对荧光素酶活性(1.72±0.16)则无显著差异(P>0.05)，见图1。

图1 生物信息学分析miR-206和CXCR4的靶向关系

2.3miR-206表达对食管癌细胞增殖的影响 与GFP-NC组比较，GFP-miR-206组24 h、48 h和72 h的增殖活力显著下降(P<0.05)；与GFP-miR-206组比较，GFP-miR-206/CXCR4-OE组24 h、48 h和72 h的增殖活力明显回升(P<0.05)，见表1。

表1 miR-206表达对细胞增殖活力的影响

2.4miR-206表达对食管癌癌细胞迁移的影响 与GFP-NC组〔(94.04±7.75)个〕比较，GFP-miR-206组迁移细胞数〔(35.11±93.28)个〕显著下降(P<0.05)；与GFP-miR-206组比较，GFP-miR-206/CXCR4-OE组的迁移细胞数〔(74.88±6.84)个〕明显回升(P<0.05)，见图2。

图2 miR-206表达对细胞迁移的影响(结晶紫染色，×400)

2.5miR-206对表皮生长因子受体(EGFR)、VEGF表达的影响 CXCR4在GFP-NC、GFP-miR-206和GFP-miR-206/CXCR4-OE组细胞中的相对表达水平分别为1.36±0.10、0.45±0.06和1.52±0.14；EGFR的相对表达水平分别为1.52±0.12、0.47±0.05和1.08±0.09；VEGF的相对表达水平分别为1.47±0.12、0.30±0.04和1.11±0.11。与GFP-NC组细胞比较，GFP-miR-206组细胞EGFR和VEGF的蛋白表达显著降低(P<0.05)；与GFP-miR-206组细胞比较，GFP-miR-206/CXCR4-OE组细胞EGFR和VEGF的蛋白表达显著上升(P<0.05)，见图3。

1～3:GFP-NC组，GFP-miR-206组，GFP-miR-206/CXCR4-OE组

3 讨 论

miR-206广泛存在于机体多种组织、器官和细胞中，在正常生理状态下呈高表达，而在大部分肿瘤组织中呈低表达，并与肿瘤的增殖、侵袭、转移及血管生成的发生密切相关〔7〕。但miR-206在食管癌细胞中的表达和作用机制尚不清楚。本研究结果表明miR-206的异常表达在食管癌细胞的发生发展中起着重要作用。

CXCR4作为一种高度保守的七次跨膜G蛋白耦联受体(GPCRs)，可通过与其配体基质细胞衍生因子(SDF-1/CXCL12a)等的结合，激活下游丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多条信号通路，在细胞骨架重排、肌动蛋白调动、细胞间信息传递、炎症细胞迁移、黏附及肿瘤转移中发挥着重要的生理病理功能〔8，9〕。研究显示，CXCR4在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤等数十种癌症中高表达，在肿瘤的生长、器官特异性转移及肿瘤免疫抑制中发挥关键作用〔10，11〕。此外，CXCR4在食管癌组织中高表达，并与肿瘤组织浸润程度、淋巴结转移及预后密切相关〔12〕。生物信息学和双荧光素酶报告实验显示CXCR4是miR-206的下游靶向基因，表明miR-206可能通过调控CXCR4表达进而改变食管癌细胞生物行为学。

细胞增殖和细胞迁移实验进一步证明，与对照食管癌细胞比较，miR-206过表达后，细胞的增殖和迁移能力下降，而在miR-206过表达细胞中重新过表达CXCR4后，细胞的增殖和迁移能力又出现明显的回升，表明miR-206可通过反向下调CXCR4的表达促进食管癌细胞的增殖和迁移。

研究表明VEGF是一种在恶性肿瘤中高表达的血管内皮生长因子，在肿瘤细胞的侵袭、迁移、黏附及血管形成等发明起着关键的调节作用，而VEGF的上述调节功能与CXCR4的表达密切相关〔13〕。Liang等〔14〕的研究证明SDF-1/CXCR4通过促进Akt的磷酸化，促进肿瘤细胞中VEGF的表达。EGFR作为细胞膜表面的表皮生长因子受体，可与表皮生长因子(EGF)结合激活下游一系列信号转导通路，调控细胞的增殖、生长和凋亡，并与肿瘤的形成和发展密切相关〔15〕。研究显示，Porcile等〔16〕的研究显示CXCR4可通过刺激EGFR的磷酸化，激活ERK1/2和Akt等细胞内信号通路，进而参与卵巢癌的浸润和转移。本研究结果表明miR-206可通过CXCR4调控EGFR和VEGF的表达，并在食管癌细胞的增殖和迁移中发挥重要作用。

综上所述，miR-206可通过靶向CXCR4抑下调EGFR和VEGF的表达和活化，抑制食管癌细胞的增殖和迁移，有望为食管癌的临床诊疗和预后评估开辟新的思路。