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circ_0031739通过下调miR-98-5p促进高糖诱导的心肌细胞损伤

2022-12-06杜美玲王晓元李会贤李方江张爱爱

中国老年学杂志 2022年23期
关键词:高糖荧光素酶心肌细胞

杜美玲 王晓元 李会贤 李方江 张爱爱

(河北北方学院附属第一医院心血管内科,河北 张家口 075400)

糖尿病是一种以长期高血糖为特征的代谢性疾病,随着人们生活水平和饮食习惯的改变,其发病率呈不断上升趋势,已成为21世纪全球最严重的公共卫生问题之一〔1,2〕。人体异常的葡萄糖水平可导致多种严重并发症,其中糖尿病心肌病是糖尿病的心血管并发症,也是糖尿病致死致残的主要原因〔3〕。研究表明〔4,5〕,高糖诱导心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病发生和发展的重要因素。

环状RNA(circRNA)是一类具有闭合环状结构的非编码RNA〔6〕。近年来多项研究表明〔7~9〕,circRNA在糖尿病及其并发症中发挥重要调控作用。如房远等报道〔10〕,circ_0031739在糖尿病患者血清和高糖处理的人脐静脉内皮细胞中均出现高表达,提示circ_0031739可能参与了糖尿病的病理机制。但目前circRNA在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用及机制鲜有报道。本研究探讨circ_0031739在高糖诱导的心肌细胞损伤中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1主要材料和仪器 DMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Gibco公司);青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司);葡萄糖(北京索莱宝科技有限公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(中国Takara公司);CCK8试剂(美国Sigma公司);膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/磺化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);ABI 7500型定量PCR仪(美国ABI公司);HBS-1101酶标分析仪(南京德铁实验设备有限公司);FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2细胞培养 人心肌细胞系AC16购自美国 Millipore公司。细胞接种于含有1%青霉素和链霉素、12%胎牛血清的DMEM培养液,放入37℃,5% CO2的培养箱中培养。

1.3方法

1.3.1细胞转染及分组 对数生长其的AC16细胞分为以下组别,即为对照组:用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液培养;高糖+si-NC组、高糖+si-circ#1组、高糖+si-circ#2组、高糖+miR-NC组、高糖+miR-98-5p组、高糖+si-circ#1+anti-miR-NC组、高糖+si-circ#1+anti-miR-98-5p组:使用Lipofectamine3000转染试剂分别将小干扰RNA(siRNA)阴性对照、circ-0031739 siRNA#1、circ-0031739 siRNA#2、miRNAmimics、miR-98-5pmimics及circ-0031739 siRNA#1+miRNAinhibitor、circ-0031739 siRNA#1+miR-98-5p inhibitor转染至细胞,转染48 h后,用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液培养。

1.3.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验 收集各组生长至对数期的细胞,采用Trizol法提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度和质量,使用逆转录试剂盒反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行qRT-PCR,程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环。qRT-PCR用circ_0031739、miR-98-5p、U6、GAPDH引物由广州锐博生物科技有限公司合成。结果采用2-△△Ct法计算circ_0031739、miR-98-5p的相对表达水平。

1.3.3CCK8实验检测细胞增殖活性 收集各组生长至对数期的细胞,消化后制成浓度为1×105/ml的单细胞悬液,以每孔200 μl接种于96孔板中,每组细胞设置5个重复孔,放入培养箱培养24 h后,吸除孔内培养液,分别加入含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液或含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液,继续培养24 h。然后向每孔加入10 μl CCK8溶液,孵育4 h。使用酶标仪检测每孔在450 nm处的吸光度(OD)值。

1.3.4流式细胞仪检测细胞凋亡 收集处理后的各组细胞,消化并制成浓度为1×105ml的单细胞悬液,离心,PBS冲洗细胞。参照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书,加入1×结合缓冲液重悬细胞,然后分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,混匀,避光反应20 min。1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.5双荧光素酶实验 通过circBank网站预测到circ_0031739与miR-98-5p具有结合位点。将含有miR-98-5p结合位点的circ_0031739片段及突变片段克隆到荧光素酶报告载体,分别命名为circ_0031739-WT、circ_0031739-MUT,然后分别与miR-NC、miR-98-5p共转染心肌细胞,转染48 h后,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞中荧光素酶活性。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件进行LSD-t检验、方差分析。

2 结 果

2.1circ_0031739在高糖诱导的心肌细胞中高表达 与对照组比较,高糖组心肌细胞中circ_0031739相对表达量明显升高(1.00±0.06 vs 3.22±0.42,P<0.05)。

2.2抑制circ_0031739对高糖诱导的心肌细胞增殖和凋亡的影响 与对照组和si-NC组比较,高糖+si-circ#1组和高糖+si-circ#2组心肌细胞中circ_0031739的相对表达量明显减少(1.00±0.05、1.00±0.03 vs 0.31±0.05,1.00±0.05、1.00±0.03 vs 0.49±0.08,P<0.05),高糖+si-circ#1的抑制效率最佳,用于后续实验。

CCK-8实验结果显示,与对照组比较,24、48、72 h时高糖组心肌细胞的增殖活性明显降低(P<0.05);与高糖+si-NC组比较,48、72 h时高糖+si-circ#1组心肌细胞的增殖活性明显升高(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示,与对照组比较,高糖组心肌细胞的凋亡率明显升高(P<0.05);与高糖+si-NC组比较,高糖+si-circ#1组心肌细胞的凋亡率明显降低(P<0.05)。见图1和表1。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

表1 抑制circ_0031739对高糖诱导的心肌细胞增殖和凋亡的影响

2.3circ_0031739靶向结合miR-98-5p 通过circBank网站预测到circ_0031739与miR-98-5p具有靶向结合位点,见图2。双荧光素酶实验结果,circ_0031739 WT和miR-98-5p共转染的心肌细胞中荧光素酶活性明显降低(P<0.05),见表2。qRT-PCR结果显示,与对照组和si-NC组比较,si-circ#1组心肌细胞中miR-98-5p相对表达水平明显升高(1.00±0.09、1.00±0.12 vs 3.41±0.34,P<0.05)。

图2 circ_0031739与miR-98-5p的靶向结合位点

表2 双荧光素酶活性检测结果

2.4过表达miR-98-5p对高糖诱导的心肌细胞增殖和凋亡的影响 qRT-PCR结果显示,与对照组比较,高糖组心肌细胞中miR-98-5p相对表达量明显降低(1.00±0.06 vs 0.49±0.07,P<0.05)。miR-98-5p过表达效率检测结果,与空白组和miR-NC组比较,miR-98-5p组心肌细胞中miR-98-5p相对表达量明显升高(1.00±0.10、1.00±0.13 vs 5.63±0.69,P<0.05)。CCK8和流式细胞仪检测细胞增殖活力和凋亡率,与对照组比较,48、72 h时高糖组心肌细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率明显升高(均P<0.05);与高糖+miR-NC组比较,48、72 h时高糖+miR-98-5p组心肌细胞增殖活性明显增强,凋亡率明显降低(均P<0.05)。见图3和表3。

表3 过表达miR-98-5p对高糖诱导的心肌细胞增殖和凋亡的影响

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

2.5抑制miR-98-5p逆转抑制circ_0031739对高糖诱导的心肌细胞增殖和凋亡的保护作用 与空白组和anti-NC组比较,anti-miR-98-5p组心肌细胞中miR-98-5p相对表达量明显降低(1.00±0.06、1.00±0.04 vs 0.39±0.07,P<0.05)。CCK8实验和流式细胞仪检测细胞增殖活性和凋亡率,与高糖+si-NC组比较,24、48、72 h时高糖+si-circ#1组心肌细胞增殖活性明显升高,细胞凋亡率明显降低(均P<0.05);与高糖+ si-circ#1+anti-miR-NC组比较,高糖+ si-circ#1+anti-miR-98-5p组细胞24、48、72 h时增殖活性明显降低,细胞凋亡率明显升高(均P<0.05)。见图4和表4。

图4 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

表4 抑制miR-98-5p逆转circ_0031739的作用

3 讨 论

糖尿病心肌病主要病理特征是心肌细胞凋亡、心肌纤维化、代谢紊乱及微血管病变等〔11〕。心肌细胞凋亡与心血管疾病的发生及发展密切相关,牟娇等〔12〕通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病大鼠模型,发现糖尿病大鼠构建成功第4周,大鼠心肌细胞凋亡明显增加,且随着糖尿病形成时间的延长,心肌细胞凋亡逐渐加重,说明心肌细胞凋亡参与糖尿病心肌病的发展过程。Zhang等〔13〕研究发现高糖可以激活心肌细胞内源性和外源性凋亡通路,诱导乳鼠心肌细胞凋亡。提示高糖可通过多种途径诱导心肌细胞凋亡,进而参与糖尿病心肌病的进展。

circRNA多位于细胞质中,具有稳定性、保守性、组织特异性等特性,已被发现在糖尿病、心血管疾病及神经系统疾病等多种疾病的发生及发展中发挥重要调控作用〔14~16〕。Zhou等〔17〕研究发现circ_010567在糖尿病小鼠心肌和心脏成纤维细胞中均显著上调,功能实验证实敲除circ_010567能够抑制小鼠心肌纤维化。Li等〔18〕研究发现circNCX1在缺氧再灌注刺激的心肌细胞中高表达,促进心肌细胞凋亡,而心肌缺血再灌注小鼠的心肌细胞和心脏组织中circNCX1表达的降低可减轻心肌细胞凋亡和缺血再灌注损伤。本研究结果说明circ_0031739高表达参与高糖诱导的心肌细胞凋亡过程,敲除circ_0031739则能够减弱高糖诱导的心肌细胞凋亡,促进心肌细胞增殖,对心肌细胞起保护作用。circRNA的功能研究表明〔19,20〕,circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,在细胞中主要作为miRNA的海绵起作用。miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA,在机体各种组织和器官中广泛表达,参与调节多种细胞的生理和病理过程〔21〕。李祖霞等〔22〕研究表明,高糖可诱导小鼠心肌细胞中miR-26a和miR-197表达升高,干扰miR-26a和miR-197可通过调节MCL1基因表达,促进高糖诱导的心肌细胞增殖活力,降低细胞凋亡率。miR-98被报道在缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤中表达降低,而姜黄素可通过上调miR-98减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤〔23〕。此外,有研究表明〔24,25〕,miR-98在心肌炎和心肌梗死中表达降低,参与调节心肌细胞凋亡。

本研究证实抑制circ_0031739能够上调细胞中miR-98-5p的表达。进一步功能实验分析发现,过表达miR-98-5p能够增强高糖诱导的心肌细胞增殖活性,减少细胞凋亡,而将miR-98-5p inhibitor和circ_0031739 siRNA共转染细胞后, circ_0031739对高糖诱导的心肌细胞的保护作用减弱或消失,说明抑制circ_0031739对高糖诱导的心肌细胞的保护作用是通过上调miR-98-5p实现的。

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