单细胞组学在早期妊娠母胎界面异质性中的研究进展*

金贝贝，杨晓清

(1.南通大学医学院，南通 226006；2.南通大学附属医院妇产科，南通 226001)

妊娠早期是胚胎着床和胎盘形成的关键时期，其中早期妊娠丢失约占总妊娠丢失的80%，部分妊娠晚期的严重并发症在妊娠早期就能被预测到[1]。胚胎一直以来被认为是母体的“同种异体移植物”，带有父系基因的胚胎如何在母体内稳定存在一直是科研人员研究的热点话题。母胎界面作为母体与胎儿直接交流对话的“接触面”，除了有胎儿来源的绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast,EVT)外，还包括母体来源的蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)和蜕膜免疫细胞(decidual immune cell,DIC)。母胎界面细胞因子平衡的失调将会导致流产、子痫等不良妊娠结局事件的发生[2-3]，因此维持母胎界面各细胞群间以及细胞内部的动态平衡是妊娠成功的关键因素[4]。

细胞具有异质性，相同种类的细胞其基因型和表型可能不同，相同表型的细胞其遗传信息也可能存在显著差异。母胎界面组织的异质性问题是制约早期自然流产甚至复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)等妊娠相关疾病有效治疗的关键因素。单细胞组学研究技术可从单个细胞水平分析母胎界面组织中各种细胞类型、细胞亚群及基因表达的差异性等因素，有助于揭示细胞间和细胞内交互对话的机制，从而更好地理解细胞异质性。本综述通过分析近年来单细胞组学技术在早期妊娠母胎界面异质性中的相关研究，旨在深入探究母胎界面组织的异质性以及进一步了解母胎免疫耐受的潜在机制，为临床疾病的治疗与研究提供指导方向。

1 单细胞组学

单细胞组学技术是基于单个细胞分离技术的水平，探究细胞群体间及细胞内部动态分化的新兴技术，主要包括单细胞基因组学、单细胞转录组学、单细胞蛋白组学、单细胞代谢组学以及单细胞表观基因组学。不同于以往高通量测序技术，单细胞组学技术不仅能深入分析所测单个细胞亚群以及基因表达水平的差异性，也有助于进一步探究细胞谱系、细胞分化轨迹的关系，构建各细胞亚群间的互作网络。目前单细胞组学的相关研究已在多个学科领域获得突破进展，包括肿瘤学、生殖、干细胞领域等[5-7]。近年来，单细胞组学技术不断发展，其中单细胞测序技术在妊娠早期的研究应用尤为广泛，这不仅促进了母胎界面细胞分化发育及细胞命运的研究，也推动了母胎医学的研究进展。

2 单细胞组学技术在蜕膜基质细胞中的研究

DSC是蜕膜组织的主要组成部分，可分泌多种因子共同调节早期妊娠母胎界面微环境，包括IGFBP1、PRL、白介素等[8]。作为DSC所分泌因子的主要组成部分及蜕膜化的重要指标，IGFBP1和PRL在母胎界面也表现出差异表达的特征。Vento-tormo等[9]通过单细胞转录组学技术全面解析妊娠早期的DSC并将其分为3种细胞亚群，DS1细胞亚群缺乏蜕膜经典分子标志物IGFBP1和PRL的表达，DS2和DS3细胞亚群表达IGFBP1，DS3细胞亚群表达PRL，且三类DSC亚群分布位置不同，进而说明DSC在母胎界面组织具有差异表达的异质性特征。DSC这一异质性不仅表现在妊娠早期，在妊娠晚期也有蜕膜异质性的表现。Huang等[10]通过单细胞RNA测序研究分娩前后的蜕膜组织细胞也得出相近的结论，揭示了有关分娩期蜕膜组织的异质性，该研究不仅为妊娠早期母胎界面蜕膜组织的差异表达提供了基于单细胞组学技术研究的证据，也为将来围产医学DSC的研究提供了指导。

3 单细胞组学技术在蜕膜免疫细胞中的研究

在正常妊娠中，胚胎作为“外来物质”能够免受母体免疫系统的排斥并且能在母体内稳定存在，这与母胎界面免疫微环境稳态以及特殊的免疫耐受机制密切相关。在早期妊娠中，蜕膜免疫细胞包含多种免疫细胞类型，其中蜕膜NK细胞(decidual natural killer cell,dNK)占比最多[11]，其次是蜕膜巨噬细胞(decidual macrophage,DM)、T细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)等[12]，各种免疫细胞类型及其分泌的细胞因子等协同作用以维持母胎界面免疫耐受平衡。

3.1 单细胞组学技术在蜕膜自然杀伤细胞中的研究 早期妊娠期间，dNK细胞是占比最多的蜕膜免疫细胞群，约占50%～70%。随着妊娠的进行，子宮内膜迅速蜕膜化，CD56brightCD25+dNK细胞优先被募集到母胎界面[13]，具有耐受表型的CD56brightCD16-dNK细胞数量迅速增加。同时，dNK细胞分泌多种细胞因子、生长因子，在调节滋养细胞侵袭、子宫螺旋动脉重构、胎儿生长发育等多方面发挥重要作用[14-17]，但dNK细胞在早期妊娠母胎界面中的具体作用机制仍不明确。Vento-tormo等[9]基于单细胞转录组测序技术和分层聚类等方法对妊娠6～14周的蜕膜和胎盘进行研究，发现dNK细胞3个细胞亚群具有不同的分子特征和免疫调节功能。dNK1细胞亚群高表达CSF1、LILRB1受体和KIR基因，与EVT相互作用，同时表达参与糖酵解的酶以引发代谢；dNK2细胞和dNK3细胞高表达XCL1，防止免疫激活；dNK3细胞高表达CCL5。研究者还通过开发配体-受体库预测不同细胞类型分子的互作，构建母胎界面单细胞图谱，揭示早期妊娠母胎界面组织细胞交流互作的通讯机制，为探究母胎界面免疫微环境的研究提供新的思路。Guo等[2]对正常早期妊娠者及RSA患者的dNK细胞进行单细胞RNA测序分析，探讨dNK细胞亚群及其在母胎界面的功能，表明dNK1细胞高表达KIR基因家族成员及LILRB1，具有支持胚胎生长活性的功能；dNK2细胞和dNK3细胞高度富集细胞因子介导的信号通路基因，倾向于细胞因子分泌的功能；dNK3细胞高表达IFNG免疫调节基因，推测dNK1细胞数量减少、IFNG基因表达量显著增加可能导致RSA的发生，从单细胞角度对既往研究进行了补充说明[18-19]，促进了我们对疾病状态下母胎界面异质性的理解，为RSA临床免疫治疗研究提供新的视角。

3.2 单细胞组学技术在蜕膜巨噬细胞中的研究 DM是早期妊娠母胎界面第二大免疫细胞群体，在重塑子宫螺旋动脉、维持母胎界面免疫耐受等方面发挥重要作用[20-21]。既往研究通常将DM分为促炎性M1型和抗炎性M2型两种细胞类型[22]，DM在妊娠初期偏向M1型，随着妊娠的进行，在胎盘形成后主要向M2型转变[23]。Guo等[2]从单细胞水平检测母胎界面DM的异质性，将DM分为mac1和mac2两种细胞亚群，研究其差异基因并结合富集分析表明：在正常早期妊娠者中，mac1细胞与中性粒细胞介导的免疫作用有关，mac2细胞与NK细胞趋化性调节作用有关，mac1细胞和mac2细胞分别表征M1和M2基因特性。在RSA病理妊娠状态下，DM总量显著减少且有T细胞趋化性，其中mac1细胞亚群的功能增强和比例增加伴随着mac2细胞亚群数量显著减少，这与M1/M2两种分型作用相似。

然而，有研究者认为部分DM细胞不适合常规M1/M2分型，Houser等[24]根据CD11c表达水平将CD45+CD14+DM分为CD11cHIDM和CD11cLODM两种类型，且其分别产生促炎性和抗炎性因子，在母胎界面表达独特的基因特征和功能，以共同维持母胎免疫微环境的平衡。Jiang等[25]在此基础上首次鉴定出DM三个不同亚群的存在，促进DM在妊娠早期母胎界面异质性中的研究。Chen等[26]通过单细胞RNA测序技术研究表明富含于RSA蜕膜组织的第6巨噬细胞亚群同时高表达M1和M2基因组合特征，不同于传统M1/M2分型，在疾病状态下从单细胞和分子方面进一步探讨了DM的分型问题，为探究不明原因RSA患者的发病机制及诊疗方案提供了新思路。

3.3 单细胞组学技术在T细胞中的研究 蜕膜T细胞参与维持母胎界面免疫耐受，主要包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和FOXP3+调节性T细胞。Guo等[2]鉴定并分析了上述3种T细胞，研究发现RSA患者T细胞各亚群的细胞因子介导的信号通路及其促炎特性均有增强，表明RSA蜕膜免疫微环境以Th1型为主，推测改变蜕膜免疫细胞亚群的比例可能有助于将RSA病理妊娠转变为正常妊娠。Wang等[27]对孕6～8周的正常妊娠者和RSA患者的蜕膜组织及外周白细胞进行了综合分析，同样表明RSA患者的蜕膜T细胞优先表现为促炎特性，并首次通过单细胞组学技术发现外周血中黏膜相关恒定T细胞(mucosal-associated invariant T cell,MAIT)的激活可能与母体的炎症状态有关，进一步推动了早期妊娠失败的免疫发病机制的研究。然而，RSA疾病状态下的蜕膜免疫异质性在很大程度上仍然未知。为进一步揭示蜕膜T细胞潜在的功能亚型，Chen等[26]对T细胞亚群的特异性表达基因进行了差异分析，研究表明早期妊娠期间CD4+T细胞的调节作用和CD8+T细胞的细胞毒性作用相互协调，共同维持蜕膜免疫微环境的平衡，但T细胞在母胎界面的异质性表现仍有待进一步探究。

3.4 单细胞组学技术在DC中的研究 DC在蜕膜免疫细胞中占比较少，约1%～2%，是妊娠期关键的抗原提呈细胞，在母胎界面发挥重要的免疫调节作用。根据成熟度分类，DC可分为CD83+成熟的树突状细胞(mDC)、CD209+(DC-SIGN)未成熟的树突状细胞(imDC)和中间态DEC-205+DC，妊娠早期以DC-SIGN+DC为主。近年来，Villani等[28]利用单细胞RNA测序技术探究人血液中DC的新细胞亚型及表达特征，促进人类免疫细胞图谱的建立。Suryawanshi等[29]对妊娠6～11周的胎盘及蜕膜进行单细胞组学研究，绘制妊娠早期胎盘绒毛和蜕膜细胞转录图谱，表明DC1属于CLEC9A+亚型，DC2属于CD1C+亚型，与Villani等[28]研究一致。Chen等[26]通过单细胞RNA测序对正常妊娠者及RSA患者的蜕膜进行研究，结合基因表达谱评估DC亚群的细胞特征，阐明多数DC属于cDC1谱系，少数DC属于cDC2谱系，提出部分来源于RSA蜕膜的呈激活态的DC所致的免疫紊乱可能与RSA发病有关。目前基于单细胞组学技术分析DC在早期妊娠母胎界面的相关研究较少，尚不明确DC确切的细胞亚群分型及功能特征。

4 单细胞组学技术在绒毛外滋养层细胞中的研究

EVT的侵袭作用是母胎界面形成的起始及关键因素[30]。在妊娠过程中，胚胎来源的EVT侵入蜕膜，与母体免疫细胞互作重塑母体子宫螺旋动脉，使得胎儿获得充足的营养和能量支持，在胚胎着床、胎盘形成以及维持母胎耐受的过程中发挥重要作用。Suryawanshi等[29]鉴定分析早期妊娠中绒毛和蜕膜组织的主要细胞类型及基因特征，在确定已知EVT标志物的同时也发现了新的EVT标志物，包括HTRA4，这为先前报道的HTRA4与EVT侵袭及分化作用的相关研究提供了基于单细胞组学技术的论据支撑[31]。同时研究表明，妊娠早期EVT表达具有抗炎作用的MMP12，而非妊娠晚期高度表达的MMP11[32]，体现EVT从孕早期抗炎作用到孕晚期高度浸润作用的动态转变，有助于了解不同妊娠状态下细胞功能的动态变化过程。Liu等[33]将妊娠8周的胎盘EVT分为3个细胞亚群，富集分析各细胞亚群的功能并剖析其高表达的特异性基因，表明EVT_8W_1亚群倾向于增殖作用，高表达RRM2；EVT_8W_3亚群倾向于免疫调节作用，高表达TAC3、SERPINE1等基因；EVT_8W_2亚群的基因表达水平居中位。研究还发现EVT表达多种多肽激素基因，虽未能鉴定出已知的部分EVT,如血管内EVT等，但仍能帮助我们更好地理解EVT在母胎界面的异质性表现。

5 总结与展望

近年来，单细胞组学技术促进了我们对妊娠早期母胎界面组织异质性的深入理解，推动了生殖医学及母胎医学研究领域的发展进程，极大地加速了“人类细胞图谱”的构建，为探究细胞命运及异质性的研究提供了有力的技术支撑[34]。目前，单细胞组学技术不断成熟，但其在早期妊娠母胎界面中的研究仍较少，且主要通过单细胞转录组测序技术来完成。未来，我们仍需要在单细胞高分辨率技术的支持下对母胎界面进行多组学的深入探究，以期最终减少妊娠期母胎疾患的发生率，保障母胎健康。