间充质干细胞外泌体的特点及其在宫腔粘连中的研究进展

李 晓，段 华

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇科微创中心，北京 100006)

宫腔粘连(intrauterine adhesion，IUA)是一种子宫内膜损伤性疾病，子宫内膜细胞被细胞外基质取代，大量成纤维细胞沉积在内膜部位，子宫内膜发生纤维化，该过程可能与子宫内膜干细胞缺失有关[1]。随着间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)研究的不断深入，其抗纤维化作用已得到证实。近年研究发现，外泌体作为MSCs旁分泌活动的主要方式之一，在促进损伤子宫内膜再生修复和抑制纤维化中发挥重要作用。

1 MSCs外泌体的基本特点

1.1 MSCs外泌体概述 MSCs是起源于早期中胚层的一种多能干细胞，在组织器官损伤性疾病的治疗中备受青睐。近年，有研究发现MSCs可能通过外泌体(exosomes)介导的旁分泌作用来发挥抗炎、抗凋亡、抗氧化和促进血管新生等生物学功能[2]，在修复损伤器官中具有重要地位。

外泌体是一类直径约为30～150nm的膜性囊泡，在透射电镜下显示为经典的茶托样结构。几乎所有活细胞都可以分泌外泌体[3]，故其广泛分布于血液、尿液、乳汁和腹水等体液中。1987年，科学家在绵羊网织红细胞中首次发现外泌体[4]，最初认为这是细胞代谢废物的“垃圾袋”；但随着研究的深入，发现外泌体内含有多种细胞活性成分，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等[5]，在组织损伤修复中参与细胞间通讯和信息传递。

与单纯应用MSCs相比，MSCs外泌体来源广泛、易于获得，不仅具有与其亲本细胞类似的生物学特性，而且具有以下优势：(1)安全性：外泌体的纳米级结构使其易于被靶细胞摄取，并可在循环血液中运输，避免了MSCs堵塞血管的风险[6]；作为天然细胞来源的纳米载体，外泌体可有效避免循环单核细胞吞噬，促进“货物”的有效传递，且没有免疫排斥反应；另外，外泌体不引起溶血和全身过敏性反应，对肝肾功能无副作用[7]。(2)稳定性：外泌体没有细胞结构，比MSCs更稳定，易于保存和质控。研究证实,外泌体在-80℃保存数月仍可维持生物学特性不变[8]。外泌体具有良好的生物相容性，可穿透质膜，易于在靶细胞内发挥作用，同时也可作为药物的载体用于生物治疗。(3)多效性：外泌体内含多种生物学活性成分，与单独应用某一活性因子所致的单一效应相比，外泌体内各活性因子之间可协同作用，在组织器官损伤的结构和功能修复中发挥多重效应。

1.2 外泌体的合成与摄取 作为细胞外囊泡的一个亚类，有别于从质膜脱落、以出芽方式分泌到胞外的微囊泡，外泌体的合成过程涉及多重环节和多个信号分子，如四次跨膜蛋白、神经酰胺和负责转运的内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)[9]。外泌体经核内体途径合成，即细胞内高尔基体转运的蛋白或细胞膜表面内化的蛋白与细胞内核酸被内吞，转运到早期内体中，后者成熟形成晚期内体，也称多囊泡小体(multiple vesicle bodies，MVBs)。一部分MVBs被溶酶体降解，而另一部分MVBs与胞膜融合后以胞吐方式将管腔内囊泡释放到胞外即产生外泌体[10]。

外泌体可通过多种方式传递信号，从而被受体细胞所摄取：(1)靶向受体细胞，通过膜表面的膜暴露蛋白、糖类或脂类等特异性分子以受体-配体结合的机制与受体细胞相互作用；(2)通过脂质筏、网格蛋白等介导的非特异性胞饮被受体细胞摄取；(3)直接与靶细胞膜融合，将外泌体转移到细胞核或内质网中，最后将内容物传递到受体细胞[10]。

1.3 MSCs外泌体的生物学特性 MSCs来源的外泌体不仅表达其亲本干细胞的标志蛋白，如CD105、CD73和CD90，也表达特定的外泌体标志蛋白，如四次跨膜蛋白(CD63、CD81和CD9等)、热休克蛋白家族(HSP60、HSP70和HSP90等)，及Alix蛋白、同线蛋白(syntenin)、肿瘤易感基因101(TSG101)和网格蛋白等[11]。双层脂质膜结构的包裹可保护外泌体内容物的稳定和转移[12]。但是，在不同生理和病理条件下，外泌体内容物的成分也有很大差异，当MSCs释放外泌体时，其内容物可被运输到受体细胞，参与抗原提呈、遗传物质转运、稳态维持、肿瘤转移及细胞微环境调控等生物学活动[13]。

2 MSCs外泌体在IUA中的作用机制

IUA是由刮宫或其他宫腔操作及感染等引起的一种子宫内膜基底层损伤性疾病，其病理特征主要为上皮细胞、基质细胞异常增生[14]，多种细胞因子和趋化因子[如转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、白介素-6(IL-6)和趋化因子配体-10(CXCL-10)]异常分泌，引起I型胶原纤维沉积造成子宫内膜纤维化和过量炎性细胞浸润；异常的炎性反应进而促进上皮细胞向成纤维细胞转化，进一步使大量纤维沉积于内膜，该过程与TGF-β1和经典Wnt信号通路的异常激活有关[15]，因此IUA也被认为是一种纤维化疾病[16]。

近年研究发现，MSCs外泌体与多种组织器官纤维化密切相关，包括子宫内膜纤维化[17]等。外泌体不仅可以参与器官纤维化的发病机制，还可作为血液、尿液等体液的纤维化标志物，为疾病诊断提供依据[18-19]。越来越多的研究已证实,外泌体所携带的非编码RNA，尤其是miRNA可在细胞间横向运输，在转录后水平调控细胞分化、增殖和凋亡等关键信号通路[20]。MSCs外泌体参与子宫内膜纤维化，促进损伤内膜再生修复的调控机制主要体现在抑制上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)、促进子宫内膜细胞增殖和血管形成及参与免疫调控等方面。

2.1 MSCs外泌体抑制EMT EMT是指上皮细胞失去极性和紧密连接，同时获得间质细胞特性[21]；其中II型EMT是炎症反应时上皮细胞向成纤维细胞方向转化，上皮细胞表现出迁移侵袭的特性，在子宫内膜损伤和纤维化中发挥重要作用[22]。

诸多体内研究实验均表明,MSCs外泌体具有逆转EMT、改善纤维化的作用。国内学者的动物模型实验揭示骨髓间充质干细胞外泌体(bone marrow mesenchymal stem cells derived exosomes，BMSCs-Exo)可通过抑制TGF-β1/Smad信号通路，减少内膜纤维化比率，增加内膜腺体数量；同时增加维持子宫内膜细胞完整性的细胞骨架蛋白CK-19的表达，而下调间质细胞标记物波形蛋白的表达，证实了BMSCs-Exo通过逆转EMT对损伤内膜的修复作用[23]。

MSCs外泌体携带的miRNA可调节EMT相关信号通路从而抑制靶细胞纤维化。在小鼠皮肤损伤模型中，脐带间充质干细胞来源的外泌体(umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes，UCMSCs-Exo)能抑制肌成纤维细胞分化和瘢痕形成；随后经基因表达数据库(GEO)、TargetScan和基因本体(GO)数据库等挖掘发现，UCMSCs-Exo内高表达的多种miRNA(如miR-145-5p、miR-21-5p和miR-125b-5p等)及下游的TGF-β1/Smad2信号通路可能是外泌体抑制损伤皮肤纤维化的机制所在[24]。近期研究结果显示，在子宫内膜异位症中，异位子宫内膜基质细胞来源的外泌体可运输miR-214，减少纤维化基因[如胶原α1(COLα1)和CTGF]的表达，为逆转子宫内膜异位症的纤维化提供可能的治疗手段[17]。Xiao等探索了BMSCs-Exo改善IUA纤维化的机制，发现BMSCs-Exo可将miR-340运输到ESCs，下调纤维化基因[胶原1A1(COL1A1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1]的表达，减少胶原沉积，并促进子宫内膜的功能性恢复。该研究结果证实了BMSCs-Exo通过运输miRNA发挥抗纤维化作用，为促进IUA内膜的无瘢痕修复提供一定借鉴价值[25]。由此可见，抑制EMT是促进子宫内膜再生修复的重要途径，MSCs外泌体可能成为抑制EMT的新载体，为治疗IUA提供新的治疗策略。

2.2 MSCs外泌体促进细胞增殖和血管生成 细胞增殖和血管生成在子宫内膜的结构和功能再生修复中尤为重要，不仅参与子宫内膜增殖期的生理进展，同时影响子宫内膜容受性，在胚胎植入中发挥重要作用[26]。MSCs外泌体内富含多种生长因子[如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、TGF-β1和IL-8等]，有助于促进细胞增殖和血管生成活性，同时显著改善子宫内膜容受性，有助于胚胎植入[27]。

在体外，UCMSCs通过外泌体促进子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells，ESCs)增殖，起效迅速、效应持久且具有剂量依赖性[28]。探讨机制发现，外泌体内miR-21-5p的表达水平显著上调；抑制其表达后，ESCs的增殖活性和增殖能力均下降；生物信息学分析则显示UCMSCs-Exo携带的miR-21-5p可通过调控多种与子宫内膜再生修复相关的信号通路，加速损伤内膜的再生修复[29]。还有研究显示,UCMSCs-Exo可抑制ESCs凋亡，激活PTEN/Akt信号通路，进而调节子宫内膜细胞生长、迁移和血管形成[30]。

在体内，研究证实BMDSCs-Exo可促进兔损害子宫内膜的腺体增生，抑制纤维化进展，从而促进子宫内膜修复[31]。Saribas等将子宫内膜间充质干细胞(uterus mesenchymal stem cell，uMSCs)及其产生的外泌体(uMSCs-Exo)移植到IUA模型宫腔中，结果证实外泌体可增加基质金属蛋白酶-2(matrix matalloproteinases 2,MMP-2)和MMP-9，降低基质金属蛋白酶-2组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2,TIMP-2)的表达，同时增加增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和白细胞分化抗原31(CD31)的表达；相较于单独使用干细胞，MSCs外泌体可在更短时间内促进子宫内膜增殖和血管形成并减少纤维化[32]。

在此基础上，诸多研究证实了MSCs外泌体可通过促进细胞增殖和血管生成提高IUA的生育力。有证据表明，脂肪间充质干细胞来源的外泌体(adipose derived mesenchymal stem cells derived exosomes，ADSCs-Exo)有助于子宫内膜再生和胶原重塑，并增加子宫内膜容受性相关蛋白[如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、整合素β3和VEGF]的表达；相较于IUA模型组，ADSCs-Exo治疗后的IUA大鼠妊娠率和胚胎植入率均显著增加，且受孕时间更短[33]。经血间充质干细胞来源的外泌体(menstrual blood mesenchymal stem cells derived exosomes，MenSCs-Exo)可迁移至子宫内膜病变部位，促进腺体新生，增加子宫内膜和肌层的血管分布，提高IUA大鼠的子宫内膜容受性，恢复其生育能力[34]。进一步研究证实，经血基质细胞来源的小细胞外囊泡(menstrual blood mesenchymal stem cells derived small extracellular vesicles，MenSCs-sEVs)可抑制TGF-β1/Smad3信号通路，并促进Smad1/5/8和Erk1/2磷酸化，促进血管新生和腺体生成，进而抑制子宫内膜纤维化[35]。上述研究说明MSCs外泌体的无细胞疗法在促进IUA模型损伤内膜的再生修复、提高其生育力方面是安全且有效的。

2.3 MSCs外泌体参与免疫调控 MSCs外泌体通过传递炎症因子、转录因子和miRNA等来调节免疫微环境，进而调节各种免疫效应细胞的增殖、成熟、极化和迁移等[36]。MSCs外泌体可触发巨噬细胞M1型向M2型极化，减少炎症因子[如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)、IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)等]的表达[37]；还可诱导辅助性T细胞1(Th1)转化为Th2，并减少T细胞向Th17转变；另外，能增加调节性T细胞(Treg)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的表达，抑制T细胞的异常激活，维持免疫平衡[38]。

近期有动物实验发现，通过将干细胞外泌体负载在胶原支架上构建生物支架/外泌体复合体(collagen scaffold and exosomes，CS/Exo)可减少CD86+细胞(M1型巨噬细胞)分泌的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α，增加CD163+细胞(M2型巨噬细胞)分泌的抗炎因子IL-10、TGF-β1和VEGFB；这可能是由外泌体所携带的miR-223介导的，后者与其靶基因stmn1的3'-非翻译区(untranslated regions，UTRs)结合，以调节M2型巨噬细胞极化，进而促进子宫内膜再生，并恢复内膜功能[39]。类似的研究发现，UCMSCs-Exo与雌激素在修复IUA大鼠损伤内膜中具有协同疗效，可显著下调多种炎症因子和纤维化相关标记物，并促进血管形成和细胞增殖，对IUA的预后具有明显改善[40]。可见，MSCs外泌体通过免疫调控可加速损伤子宫内膜的修复重建，逆转纤维化，但其作用机制以及对免疫系统的平衡调节尚需进一步探讨。

3 小 结

应用MSCs外泌体对损伤内膜进行再生修复，可突破MSCs移植的应用壁垒，提供更高的安全性和治疗特异性，为IUA的抗纤维化治疗提供了新的治疗手段。为更好发挥MSCs外泌体修复损伤内膜的天然载体功能，进一步研究应对外泌体携带的内容物及其介导的分子生物学机制深入探究。目前，有关外泌体修复损伤内膜的研究多数为短期实验，其长期疗效还需进一步研究和随访；同时，外泌体进入临床试验前对其安全剂量进行效价测定也是尤为重要的。