外泌体作为药物递送系统的研究进展#

巫瑶 于洋 朱玲 王霞 万莉红

·综述·

外泌体作为药物递送系统的研究进展#

巫瑶*1于洋2朱玲1王霞3△万莉红1△

（1. 四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041；2. 四川大学华西医院神经外科，四川 成都 610041；3. 四川大学华西第二医院检验科，四川 成都 610041）

外泌体是一种由细胞分泌的直径约40-100 nm的盘状囊泡，具有天然脂质双分子层，其内包含了复杂的RNA和蛋白质。大多数细胞在正常及病理状态下均能产生外泌体，这些外泌体主要存在于体液中，在细胞间物质运输和信号交流中发挥着重要作用。作为天然内源性纳米级载体，外泌体具有毒性小、稳定性好、、渗透性好、靶向归巢性强、能透过血脑屏障、可包载的物质种类多等特点，故可能成为具有良好应用前景的药物递送载体。本文主要介绍外泌体的基本性质、制备、载药方式，并归纳了其作为药物递送载体的研究进展。

外泌体；药物递送系统；天然内源性纳米级载体；靶向

目前已经有很多新型纳米材料被开发应用于治疗多种重大疾病[1, 2]。相比于传统药物递送载体，纳米材料尺寸小、材料和形状特殊，可在一定程度上提高疗效[3]。

但是，大部分纳米载体不能被降解，易于堆积、自由移动，从而阻塞微循环造成细胞持久性损伤，因此存在潜在的安全性问题[4]。而外泌体是生物体在正常或者病理状态下产生的纳米级细胞囊泡，具有与脂质体相似的膜状结构，这促使研究者们开始思考能否将药物装载到脂质体中的经验应用于外泌体中。此外，外泌体还具有体积小、可荷电、能被修饰具有靶向性、逃避吞噬、能透过血脑屏障等优点[5]。因此，外泌体作为天然内源性纳米载体，具有良好应用前景，可被开发用于药物的递送。

1 外泌体概况

1.1 来源

外泌体可被免疫细胞、神经元、成纤维细胞、间充质干细胞、内皮细胞和上皮细胞等多种细胞分泌产生[6]，可在血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、羊水、腹水和胆汁等多种体液中出现[7-11]。

1.2 特性

作为细胞分泌产物的外泌体具有一定的内在靶向性，如中枢神经细胞分泌的外泌体能透过血脑屏障，靶向特定的神经元[12]；缺氧肿瘤细胞来源的外泌体倾向于向缺氧肿瘤组织内聚集[13]。另外，通过设计外泌体膜表面与靶细胞特异性结合的抗体、配体或受体可实现外泌体外源靶向性。

外泌体主要有两种不同类型的靶向修饰[14-16]。一种是通过基因工程技术在外泌体膜上表达靶向多肽，从而使外泌体具有靶向功能[17]。另外一种是在外泌体膜表面直接进行修饰，如受体蛋白工程[18]。

1.3 外泌体作为药物递送系统的应用

外泌体可用于包载小分子药物，使药物在靶细胞内富集，增加小分子药物的稳定性并延长其血液循环时间，进而提高药物的疗效。

已有研究显示，一些小分子化疗药物可以被包载于外泌体中从而达到治疗疾病的作用，如紫杉醇[19]、姜黄素[20]、多柔比星[21]等。除小分子外，外泌体还可用于包载大分子，如蛋白质药物和基因药物等。

2 外泌体的制备

目前大规模生产外泌体的方法主要是自发生产和非自发生产两种方式。自发生产通过依赖中空纤维生物反应器为细胞生长提供高表面积比，进而支持高密度的细胞自发释放外泌体[22]。研究表明，自发生产方式耗时长，不适于工业化生产。

非自发生产方式主要通过增加外部刺激条件来触发细胞释放大量外泌体，非自发生产方式可分为三类：生物刺激、化学刺激、物理刺激，异同点见表1。

2.1 提取与分离

由于外泌体的形态与其他细胞外小体相似，大小范围重叠，且体积过小，使得外泌体的分离变得非常困难[23-26]。不同的分离方法所得的外泌体产量不同、操作不同、耗时不同、价格也不同，异同点见表2。其中，超速离心法常常作为外泌体提取分离的金标准[27]。

2.2 鉴定

外泌体的表征包括了粒径大小范围、表面电荷、结构和表面蛋白等，其对外泌体的性质和生物学功能非常重要，并可以影响药物的装载和输送。外泌体的鉴定主要就是对其表征的鉴定[23]。随着微流控检测技术的快速发展，我们可以实现高通量、高精度和低试剂消耗的新型外泌体检测技术，包括荧光相关显微镜（Fluorescence correlation microscopy，FCM）、比色法检测、表面等离子体共振（Surface plasmon resonance detection，SPR）检测和核磁共振（Nuclear magnetic resonance detection，NMR）检测等[23]。

此外，可以通过评估外泌体的聚散指数（Polymer dispersity index，PDI）和囊泡的zeta电位，以确定外泌体作为药物输送系统的适用性[28]。

而外泌体的浓度，则可以通过测定总蛋白质含量来确定。外泌体的RNA含量则可以通过毛细管电泳、分光光度法和实时聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）来测定。

表1 外泌体非自发生产方式

刺激方式具体方法优势劣势 生物刺激血清饥饿处理、缺氧处理、细胞因子处理（如肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素8IL-8、白细三烯B4 LTB4）快速、成本低、操作简单、可大规模生产残留大量生物活性剂、需要纯化、回收率低 化学刺激细胞松弛素B抑制肌动蛋白的聚合从而促进外泌体的释放、耗时短、操作简单需要纯化、回收率低 物理刺激物理和机械力不需要加入刺激因子耗时、产率不高

表2 外泌体分离方法

方法分离原理优势劣势 超速离心沉降系数可大规模生产、分离纯度高时间长(>4小时)、回收率低(5-25%)、重复性差 超滤大小和分子量操作简单、快速回收率低、易损坏、变形 分子尺寸排阻色谱凝胶的孔径和外泌体的大小高纯度和高产量昂贵、色谱柱易污染、分离后分析费时费力 沉降试剂盒疏水性样品量小、操作简单特异性低、成本高 免疫学分离抗原-抗体反应省时、高纯度、程序简单昂贵、不能大规模生产 电泳（DEP）分离大小和电荷快速、高产量低分辨率、低纯度 微流控芯片大小快速、成本低、便携、回收率高、工艺要求高、不能大规模生产

3 外泌体载药系统

3.1 载药方式

外泌体由脂质双分子层构成。药物主要有两种包载方式：主动包载和被动包载。不同方法所得外泌体质量不同，其药物装载率及稳定性都不相同。

3.1.1 被动包载

被动包载的方法总体上比较简单，主要分为以下两种。一种是直接将外泌体与药物进行混合后共孵育，药物会顺着浓度梯度进入外泌体中，装载率与药物的极性大小相关，但这种方法载药效率低[20]。另一种是将药物与外泌体供体细胞混合后共孵育，通过这些细胞胞吞药物后再分泌出装载了药物的外泌体[29]。这种方法的载药效率也不高[30, 31]，主要应用于包载细胞毒性较低且脂溶性较高的小分子化学药物[32]。

3.1.2 主动包载

主动包载相较于被动包载，其药物包载率更高。大分子的装载常通过主动包载这种方式被包载。主动包载主要包括超声法、挤出法、反复冻融法、电致孔法，其中超声法和挤压法会破坏膜的完整性[33, 34]，异同点见表3。

3.2 影响载药率的因素

3.2.1 外泌体/药物比例

大多数研究倾向于使用较多的外泌体，该比例的选择与药物的特性有关。疏水性药物应先溶解于有机溶剂如醇类溶剂中，稀释后再与外泌体溶液混合。而亲水性药物可预先溶解于生物相容的亲水性溶剂中，再直接与外泌体溶液混合[28]。

3.2.2 外泌体细胞来源

不同细胞来源的外泌体其表面具有不同的标记蛋白[35]。而牛奶来源的外泌体价格低廉，可用于大规模生产，常被用于天然化合物和化疗化合物的药物输送[36]，具有良好的前景[37-39]。

表3 外泌体主动包载方法

方法具体操作优势劣势 超声法均质探头超声包载率高外泌体聚集、表面蛋白结构改变 挤出法通过具有多孔膜的脂质挤出机挤出载药效率高、粒径均一改变外泌体膜的性质 反复冻融法混合物依次在室温、液氮条件下共孵育，再解冻操作简单、条件温和、可大规模生产外泌体的聚集、包载率低 电致孔法利用电场在外泌体膜上打孔操作简单RNA 沉淀、外泌体聚集

3.2.3 药物性质

外泌体的结构是基于天然的膦脂双层膜，具有亲脂性，而亲脂性药物可以很好地融入到双层结构中，不容易从膜上释放，从而具有持续释放药物的特性。根据药物的相对亲水性/疏水性，应慎重选择和优化合适的装载方法[28]。

4 总结与展望

本文主要介绍了外泌体的基本性质、制备、载药方式，并归纳了其作为药物递送载体的研究进展。

尽管外泌体作为药物载体具有生物兼容性、稳定性、内在靶向性等潜在优势，但其作为药物递送系统的研究仍然不够深入，还有很多问题有待解决，外泌体作为药物载体从实验室到市场有很长一段路要走，需要研究者的共同努力。

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（2022-04-01）

四川省科技厅重点研发项目（编号：2020YFS0103）；

巫瑶，女，四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室研究生，Email：1274795088@qq.com；

王霞，女，副主任技师，主要从事临床检验工作，Email：80832491@qq.com；

万莉红，女，教授，主要从事药理学教学与科研工作，Email：wanlihong1976@sina.com。