RNF4在神经系统疾病中的研究进展

高于婷 张如意 蔡 飞

1）湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100 2）湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100

研究表明，神经疾病如脊髓小脑共济失调（spinocerebellar ataxia，SCA）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、帕金森综合征（Parkinson’s disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，I/R）等发病率逐年升高，给患者带来严重的经济和精神负担。研究发现，适应性应激反应是细胞能够应对外在和内在危险的关键细胞机制［1］，然而，蛋白质毒性应激会导致蛋白质错误折叠，末端错误折叠蛋白的积累可以触发与神经退行性疾病相关有毒蛋白聚集体的形成。RNF4 是近年来新发现的一种可以参与错误折叠蛋白质降解的泛素连接酶，其主要在小鼠胚胎发育中的神经系统中表达，在背根神经节和发育中的性腺也有较强的表达［2］。以上研究表明RNF4 在细胞周期调控中发挥重要作用，提示RNF4这一降解错误折叠蛋白质的泛素连接酶可能在神经系统疾病中发挥作用。本文就RNF4在神经系统疾病中的研究进展进行综述，为神经系统疾病的发病机制及防治提供新的思路。

1 RNF4的生物学特征及生理功能

1.1 RNF4 的生物学特征 RNF4 发现于20 世纪90年代末，由RNF4 基因编码，位于人类染色体4p16.3上，由190个氨基酸组成［3-4］。RNF4家族包括酿酒酵母Slx5、裂殖酵母Rfp1、裂殖酵母Rfp2、网柄菌属MIP1、果蝇属CG10981和人类的RNF4和RNF111［5］。从结构上看，RNF4同源物包含有4个N末端SIMs和1个C末端RING指状域，其中SIMs可以识别SUMO修饰的蛋白，并通过环结构域催化其泛素化，从而物理连接泛素和SUMO通路，潜在地调节真核基因组的稳定性［6］。定点诱变试验结果表明，SIM2 和SIM3 在结合SUMO-2链中起主要作用，是底物高效泛素化的关键，而SIM1和SIM4起次要作用［7］。RNF4的C端环状结构域则主要促进同源二聚体化以及与E2结合酶的相互作用［8］。

RNF4 作为一种SUMO 靶向泛素连接酶，在细胞质和细胞核中均有表达，同时也是一种环蛋白，在发育中的神经和生殖系统中表达，尤其在睾丸中的表达水平非常高，在小鼠胚胎发育中的背根神经节中表达次之，而在脾脏、肾脏、结肠、心脏等组织中表达水平则相对较低，这表明RNF4可能在发育和细胞生长程序的调节中发挥关键作用［9］。另外，有研究显示，RNF4 可调节类固醇受体依赖性转录和基础转录，并与多种参与细胞生长控制的核蛋白相互作用。

1.2 RNF4 的生理功能 RNF4 可通过直接控制自身SUMO 化的E2 结合酶Ubc9 和自身SUMO 化的E3连接酶来维持SUMO 信号的动态平衡［10］。在RNF4家族成员中，RNF4 和RNF111 被证明具有SUMO 靶向泛素连接酶的功能［11］。有研究证明在siRNA清除RNF4 表达的人类细胞中，积累了高分子量的SUMO形式，表明RNF4参与了体内SUMO链修饰蛋白的降解。此外，在26S 蛋白酶体抑制剂［12］存在的情况下，高分子量的SUMO 偶联物也会大量增加，进一步表明SUMO 修饰在泛素介导的蛋白水解中起作用［13］。总的来说，RNF4具有SUMO E3 连接酶活性、泛素连接酶活性及转录调控功能［14-16］。

研究表明，细胞内的蛋白质主要通过泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）和自噬系统进行降解。而神经退行性疾病的形成与错误折叠蛋白的积累密切相关，细胞中RNF4和STUbL系统共同参与错误折叠蛋白质的降解。然而，RNF4的调节功能不仅仅是标记细胞蛋白以实现泛素介导的降解，RNF4的修饰还可以改变底物的亚细胞定位和功能动力学［17］。RNF4 作为SUMO 靶向的泛素连接酶介导了SUMO 化和泛素修饰融合，作为重要的细胞机制，涉及多种病理过程，包括癌症、心血管疾病、免疫疾病、神经疾病以及衰老［18］。因此，RNF4 在体内发挥着广泛的生理作用，其本身、受体、信号通路的研究是众多潜在疾病的治疗靶点。

2 RNF4与神经系统疾病之间的关系

2.1 RNF4与脊髓小脑共济失调之间的关系 脊髓小脑共济失调7型（spinocerebellar ataxia 7，SCA7）是一种遗传性神经系统疾病，其特征是小脑及其相关结构中的神经元严重丧失，以及黄斑变性［19-20］。突变的、错误折叠的共济失调蛋白7（polyQ-ATXN7）在细胞核内积累，RNF4 则有助于ATXN7 突变体的清除。研究表明，RNF4 和SUMO2 的过表达显著降低了polyQ-ATXN7 的水平，且在蛋白酶体抑制后，polyQ-ATXN7 的多聚泛素化显著增加，这表明RNF4能够泛素化并降解SUMO2 修饰的polyQ-ATXN7，减少错误折叠的polyQ-ATXN7。此外，有文献证明，蛋白酶体的活性会随着衰老过程而下降，在幼年小鼠中，SUMO 化通过活跃的蛋白酶体有助于突变的ATXN7 的降解，但在老年小鼠中，这种降解会受到影响，因此，ATXN7 的包涵物会随着时间的推移而增加［21］，并且研究发现蛋白酶体功能障碍通常与晚发性疾病有关，如阿尔茨海默症、帕金森症或亨廷顿病［22］。RNF4可识别和泛素化错误折叠蛋白，使这些错误折叠的蛋白成为蛋白酶体降解的靶标。除SCA7 外，RNF4 在脊髓小脑性共济失调1 型（spinocerebellar ataxia type 1，SCA1）中也发挥类似作用。突变体ataxin-1 被SUMO2 修饰，并通过RNF4靶向进行降解。另外，有研究发现RNF4消除错误折叠的蛋白质的功能依赖于SUMO2/3，因为这种能力在缺乏SUMO2/3 的细胞中受到损害，但在缺乏SUMO1 的细胞中没有。以上研究揭示了RNF4 通过SUMO修饰及泛素化去除错误折叠蛋白，并在对抗错误折叠蛋白类疾病中发挥作用［23］。

2.2 RNF4与肌萎缩侧索硬化症之间的关系 肌萎缩侧索硬化症是一种罕见的累及上、下运动神经元的神经退行性疾病，临床研究发现ALS 患者存在认知和行为功能的损害［24］，其发病机制复杂，至今仍无定论，目前认为ALS 的发病机制与免疫紊乱和异常蛋白质积累有关。在ALS 发生和发展过程中，神经元内蛋白质的降解受到明显抑制，异常蛋白质在神经元内过度积聚，形成具有不同特征表现的包涵体，并发挥神经毒性作用，造成神经元的变性、坏死［25］。为了避免有毒的蛋白质聚集，细胞进化出了细胞核和细胞质蛋白质质量控制系统，有人提出RNF4是哺乳动物PQC 系统的一部分，该系统通过SUMO 化和泛素化去除细胞核中错误折叠的蛋白质［21，23，26］。RNF4 还可调节应激颗粒（stress granule，SGs）中ALS相关FUS突变体的区域化［22］。作为对蛋白毒性应激的响应，细胞通过触发mRNAs 和RNA 结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）在胞浆SGs 中的瞬时储存来限制毒性蛋白质的合成，有研究证明，细胞核STUbL 通路与SG 动力学的调节有关。在压力情况下，许多RBPs和SG成分被SUMO启动的泛素化所靶向。此外，有证据表明，SUMO2和RNF4是正确清除热或亚砷酸盐诱导的SGs 所必需的。通常ALS 蛋白的致病突变，如FusP525L，也会导致SG 动力学的改变。目前的概念是，突变体积累在细胞质中，它们诱导SGs从液体到固体的异常转变，最终可能导致病理性包涵体的形成，这一过程在STUbL 途径缺陷时会加剧，如在SUMO2/3或RNF4耗尽时FusP525L与SGs的结合增强，那么RNF4泛素化突变蛋白的程度就会有所下降［27］。因此通常认为，通过SUMO-RNF4途径靶向RBPs 可以清除这些蛋白在细胞核中错误折叠的亚组分。然而，由于蛋白质的错误折叠是不可避免的，而且往往不能因突变、生物遗传错误或不可修复的损伤而逆转，细胞最终依赖降解系统维持蛋白质质量。但目前对这些系统仍知之甚少，尽管泛素-蛋白酶体途径以及自噬一定是这些系统的重要组成部分，但它们如何选择性地识别错误折叠的蛋白质并将其靶向降解的关键问题仍难以捉摸。

2.3 RNF4与亨廷顿舞蹈症之间的关系 亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种迟发性的神经退行性疾病，主要表现为运动、认知以及记忆功能的丧失，患者发病后15～20 a 死亡。该病具有高度的脑区选择性，主要侵害基底神经节和大脑皮质，表现为纹状体投射性GABA神经元和大脑运动皮层锥体神经元死亡［28］。至今为止，HD发病分子机制尚不清楚，但是越来越多的证据表明，转录调控异常与HD 发生密切相关［29］。突变的亨廷顿蛋白（HTT）是HD的病原体，该蛋白质在细胞内过度聚集会形成大的分子团，从而影响神经细胞的正常功能导致HD的发生。在亨廷顿病细胞模型中，细胞活力和基因表达谱会发生改变。利用酵母模型系统，研究者证明了SUMO靶向泛素连接酶SLX5降低了HD病原体亨廷顿蛋白的突变、易于聚集的片段HTT 相关的毒性和异常转录活性。在功能上还发现SLX5 的额外拷贝特异性地减少了胞浆中的HTT聚集体以及细胞核中与染色质相关的HTT 聚集体。那么，RNF4 作为SLX5的同源基因，可能也具有抑制人类细胞系中易于聚集的HTT 的异常转录活性。最后，通过基因分析发现SLX5和RNF4分别降低了HTT在酵母和人类细胞中的转录活性［30］。以上研究提示STUbL作为一种保守的机制，可以防止HTT 等聚集蛋白在染色质上积累，并抑制其在酵母和哺乳动物细胞中的错配转录活性，这一机制为未来HD的治疗提供了一个新的研究思路。

2.4 RNF4 与多巴反应性肌张力障碍之间的关系多巴反应性肌张力障碍（dopa-responsive dystonia，DRD）是由生物胺神经递质代谢异常导致的与遗传相关的运动障碍性疾病［31-32］，大多由编码多巴胺和四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）生物合成过程中酶的基因突变引起，如三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ（guanosine triphosphate cyclohydrolase Ⅰ，GCH1）基因、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因和墨蝶呤还原酶（sepiapterin reductase，SPR）基因［33］。研究发现，RNF4作为共激活因子参与了GCH基因的表达，GCH 近端启动子上的RNF4 反应元件定义为CCAAT 盒；RNF4 对该CCAAT 盒无特异的DNA 结合活性，提示RNF4可能是CCAAT和结合蛋白核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）的共激活因子；另外，将RNF4 导入神经母细胞瘤细胞系，观察到内源性GCH mRNA 水平的升高，以及RNF4 与内源性GCH启动子在染色质免疫沉淀中的相互作用［34］。以上发现不仅为GCH 的调控提供了分子基础，而且扩展了RNF4介导的基因激活机制的认识。蛋白质生成、稳定性和降解性之间的平衡是至关重要的。研究发现女性患者更容易受到HPD/DRD 的影响［35］，而RNF4可与雄激素受体和雌激素受体等类固醇受体相互作用［36-37］，通过与雄激素受体（androgen receptor，AR）的DNA结合域相互作用，作为AR反应启动子的辅助激活因子。因此，了解RNF4 是否与HPD/DRD 中GCH基因表达的性别差异具有非常重要的意义。

2.5 RNF4与多形性胶质母细胞瘤之间的关系 多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）作为颅内恶性程度最高的恶性肿瘤，患者多于确诊2 a 内死亡，具有血供丰富、高度浸润以及逃逸攻击等机制［38］。胶质瘤中存在一种具有干细胞样特征的肿瘤细胞亚群，称为胶质瘤起始细胞（glioma initiating cell，GICs）。GIC 表现出持续的自我更新，并驱动肿瘤的启动、增殖和放射/化疗耐药。研究发现，在人脑胶质瘤中，Hey1表达上调与USP11和PML下调以及恶性程度高相关。早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia，PML）蛋白可控制多种肿瘤抑制功能，并通过不完全特征化的翻译后修饰机制在不同类型的人类癌症中下调。有证据表明，泛素介导的蛋白酶体降解是导致肿瘤中PML下调的关键机制［39］。而RNF4可介导SUMO化的PML降解，这一过程可能在GBM的发展中起作用，因此，科学家们找到RNF4 的一个功能相互作用因子USP11，USP11 是一种泛素蛋白酶，在正常生长条件下具有中和RNF4的能力。USP11 的耗尽导致核体数量的减少，而RNF4的耗尽则导致相反的结果，证明了USP11可以去泛素化和稳定PML［40］。因此研究者们确定了一条PML 降解途径，其中Notch 效应子Hey1 抑制PML 特异性去泛素化酶USP11，以增强PML泛素化和降解，这种途径在胶质瘤中表现出来，在GBM中高度激活，并与GBM和GICs的恶性特征有关，阻断此通路可能是治疗侵袭性GBM的一种治疗策略［41］。

3 结语及展望

RNF4 是一种SUMO 靶向的泛素连接酶，通过泛素蛋白酶体途径和细胞信号调控参与多种病理生理过程，其中泛素并且靶向降解错误折叠的蛋白质在研究神经退行性疾病中发挥重要作用。此外，其可通过参与转录过程以及作为核因子的共激活因子在某些神经疾病中发挥作用。但是以上研究都是在动物体内进行的，在人类是否会产生同样的作用有待进一步研究。另外，RNF4对神经退行性疾病是否还有其他通路共同作用尚不明确；RNF4对错误折叠蛋白的调节作用是通过单一通路还是多个通路共同作用尚不明确；如能设计出RNF4小分子类似物或其激动剂将有助于以RNF4为靶点治疗神经系统疾病。