NOTCH2NLC基因与神经系统疾病的相关性研究进展

林雨洁 刘 红 李宏宇 王 凯 王 钰

长治医学院附属和平医院，山西 长治 046000

大脑皮质的发育是一个极其复杂的过程，Notch信号通路在进化上非常保守，是哺乳动物皮层神经元数量的决定因素，可促进人类皮质祖细胞的自我更新并阻止分化，决定了神经前体细胞增殖和神经元分化的时间和持续时间。Notch 信号通路中某一关键分子突变，都有可能导致一系列的神经系统疾病。NOTCH2NL 作为Notch 信号和神经发生的特异性修饰物，可通过细胞自主激活Notch途径扩大人类皮质祖细胞并增加其在克隆水平上的神经元输出，从而参与人类大脑皮质的进化。NOTCH2NL基因具有4 种 同 源 基 因：NOTCH2NLA、NOTCH2NLB 和NOTCH2NLC 位于1q21.1 位点，NOTCH2NLR（14%的人缺乏），每个NOTCH2NL 基因大于100 kb 的基因组区域与NOTCH2 序列同源性＞99.1%，NOTCH2NL的各个拷贝在chr 着丝粒的两侧以串联重复的形式分布，且在人类皮质祖细胞中高度表达。NOTCH2NL基因的缺失和复制与神经发育表型有关，1q21.1 位点基因组稳定性的丧失，会导致神经发育障碍。NOTCH2NLC 基因于2018 年才被首次发现，但其致病性和功能尚未清楚，直到发现其与神经元包涵体病密切相关，其致病机制才逐渐被认识。随后，陆续的一些研究发现NOTCH2NLC 基因5’非翻译区GGC的重复扩增与许多神经退行性疾病均相关，如神经元包涵体病、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、特发性震颤、帕金森病、成人脑白质病变及多系统萎缩等。这些神经退行性疾病重叠，可能具有共同的病因。因此，对NOTCH2NL 以及NOTCH2NLC 基因5’非翻译区GGC 的重复扩增在神经变性疾病中的作用机制进行研究，从而可以找到其共同的联系，并揭示为何相似的基因突变却导致不同疾病的原因，有助于寻找针对这些疾病的新药，提供新的治疗方案。

1 Notch信号通路

Notch 信号通路是一个进化上非常保守的信号传导系统，由Notch 受体、Notch 配体、靶基因和DNA转录因子等组成。Notch 广泛表达于从无脊椎动物到脊椎动物等多个物种。Notch 信号通路通过受体与配体间相互作用来精确调控各谱系细胞及组织的分化。Notch受体能够转导细胞信号，参与细胞生命活动。Notch受体与不同的配体相互作用，参加细胞的一系列形态发展，包括增殖、分化，决定了神经前体细胞增殖和神经元分化的时间和持续时间，影响突触可塑性与神经元衰老［1］。Notch信号通路的作用途径直接从细胞膜到细胞核，特异性极强，其信号通路中某一关键分子突变，都有可能导致一系列的神经系统疾病。Notch 信号的组成部分在大脑中表达和活跃，是成人神经干细胞的关键调节因子，也在调节未成熟和成熟神经元的迁移、形态、突触可塑性和生存方面发挥作用，对大脑发育至关重要。近年来，Notch 信号传导已被证明在一些神经疾病中在几种神经退行性疾病模型动物中发挥调节作用，并在介导几种环境因素的神经毒性中发挥调节作用［2］。

2 NOTCH2NL激活NOTCH信号通路的机制

NOTCH2NL 是NOTCH2 的一个重要家族，通过Notch途径促进自我更新，最终增加人类皮质祖细胞的神经元输出，引起人类新皮质的快速进化。功能分析表明，NOTCH2NL可通过细胞自主激活Notch通路，在克隆水平上扩增人类皮质祖细胞，增加其神经元产量［3］。Notch 是一个跨膜受体家族，由哺乳动物中的Delta 样（Dll1、Dll3 和Dll4）和锯齿状（Jag1 和Jag2）等跨膜配体激活。一旦激活，Notch 胞内域（NICD）被释放并移位到细胞核，在那里与DNA结合蛋白RBPj 形成复合物。在分子水平上，NOTCH2NL主要通过激活Notch信号发挥作用。Notch信号能控制细胞的发育途径，在神经发生过程中起着重要作用［2］。NOTCH2NL 是大脑Notch 信号通路中特异性调控因子之一［4］。NOTCH2NL 部分地通过抑制顺式分子中的Notch 配体，以细胞自主的方式发挥作用。NOTCH2NL也可以通过侧向抑制或另一种直接机制发挥非自主性作用，它还可以与其他Notch配体或受体结合。抑制DLL1 转导反式信号的能力可能会导致祖细胞产生相反的神经原效应［5］。

3 NOTCH2NLC基因

NOTCH2NL 基因是一种新的缺口样基因［5-6］，编码一种分泌性多肽，其结构与NOTCH2 基因N 端相似，具有4种同源基因：NOTCH2NLA、NOTCH2NLB和NOTCH2NLC 位于1q21.1 位点，第4 个完全不同的类似基因NOTCH2NLR（14%的人缺乏），位于1 号染色体p 臂上的NOTCH2 附近。每个NOTCH2NL 基因大于100 kb 的基因组区域与NOTCH2 序列同源性＞99.1%，且在人类皮质祖细胞中高度表达［5］。NOTCH2NLC是一种通过片段复制进化而来的基因，在放射状胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等多种放射状胶质细胞群体中高度表达，并参与了人类大脑皮质的进化［7］。NOTCH2NLC 在NOTCH2 起始密码子下游有2bp的缺失，缺少N-末端信号肽，但可产生蛋白质产物。NOTCH2NL基因的缺失和复制与神经发育表型有关，1q21.1 位点基因组稳定性的丧失，会导致神经发育障碍［3-5］。近年来，研究发现NOTCH2NLC 基因5’非翻译区GCC 重复扩增与许多神经退行性疾病，如神经元包涵体病、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、成人脑白质病变、特发性震颤等发病有关。

4 NOTCH2NL基因与神经退行性疾病

4.1 神经元核内包涵体病 神经元核内包涵体病（neuronal intranuclear inclusion disease，NIID）是一种慢性进展性神经退行性疾病，临床表现复杂多样，中枢神经系统受累常表现为痴呆、共济失调、发作性意识障碍、行为异常、震颤、癫痫发作、卒中样发作等，周围神经受累表现为：感觉障碍、远端肌力下降；还可有自主神经受累表现，如瞳孔缩小、尿失禁、晕厥等，症状上可与多种神经变性病相叠加。病理学上，NIID的特征是中枢和周围神经系统神经元细胞核内对抗泛素和抗p62 抗体呈免疫反应的嗜酸性透明包涵体形成［8］。NIID 在磁共振成像（MRI）上的特征性是经典“绸带征”，表现为灰白质交界处的弥散加权成像（DWI）异常。NIID可分为散发性和家族性两种类型，后者目前颇受关注。

基因表达异常可能参与NIID的发病。中南大学湘雅医院唐北沙教授的团队研究发现NOTCH2NLC基因的动态突变与NIID 家系相关，GGC 重复序列的扩增可能导致NIID［9］。随后的两项研究，利用长读基因组长测序（LRS）方法，发现Notch2 N 端类似C（NOTCH2NLC）基因5’UTR 区域的一个三核苷酸（GGC）n 扩展重复序列与NIID 相关［10-11］。另有学者对5 代NIID 家系进行了遗传连锁分析，并将其定位于1p13.3-q23.1。长读基因组测序在人类特异性NOTCH2NLC 中也发现GGC 重复序列，通过RP-PCR和GC-PCR 进一步证实NOTCH2NLC 基因5’UTR 区扩增的GGC重复序列（≥66）在其他家系（40例）和散发性NIID患者中均有存在。ZHANG等［9］人，在一位62岁的NIID患者家系中，检测到患者和其两个弟弟在NOTCH2NLC基因5’UTR区扩增了GGC重复序列［12］。一般认为NOTCH2NLC基因5’UTR区域GGC重复扩增次数＞60 次具有致病性，GGC 病理性重复次数与临床表现的多样性相关，如以肢体无力为表现的患者GGC 重复次数在约200 次，以认知功能障碍为主要表现者其重复次数在120 次。在NIID 家系中，除GGC序列重复扩增外，还有GGA和AGC两种重复中断形式。这些研究均提示NOTCH2NLC 基因的缺失和复制可能参与了NIID的发病。

4.2 痴呆和脑白质变性 痴呆具有临床异质性、进行性和不可逆性，症状经常重叠，神经退行性痴呆主要涉及的疾病包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、路 易 体 痴 呆（Lewy body dementia，DLB）、额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）等。其中，AD 是导致老年人痴呆的首要原因，占所有痴呆的50%～75%［13-14］，其特征是突触丢失和神经元死亡，细胞内神经原纤维缠结和细胞外Aβ斑块，临床表现为记忆减退、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆［15］。CHEN等［16］通过Notch信号转导途径，研究miR-98对AD小鼠Aβ产生、氧化应激和线粒体功能障碍的影响。分别采用MTT法和流式细胞仪检测海马神经元活性和细胞凋亡率，在AD小鼠中，发现miR-98 靶向的HEY2 和miR-98 的表达水平较低，而HEY2 的表达水平较高。MIR-98 通过抑制HEY2 使Notch 信号通路失活，从而抑制海马神经元凋亡，提高海马神经元存活率。研究表明，miR-98通过与HEY2 结合激活Notch 信号通路，减少AD 小鼠Aβ的产生，改善氧化应激和线粒体功能障碍。由此可见，Notch 信号通路调节功能的改变，导致的Notch 受体表达降低，可能会导致神经退行性病变，如诱发AD［17］。

NOTCH2NL 作为NOTCH2 的一个重要家族，随后的一项研究检测了1 004 例中国大陆地区神经退行性痴呆患者的NOTCH2NLC基因，结果发现4例散发性痴呆患者携带NOTCH2NLC重复扩增，在4例突变携带者中，3 名和1 名分别被临床诊断为AD 和额颞痴呆FTD。此外，其中3例在T2-FLAIR成像中发现脑白质病变。该研究表明NOTCH2NLC 重复扩增可能与AD 或FTD 样表型以及白质脑病有关。但NOTCH2NLC 的扩增频率明显低于NIID 患者［18］。TIAN等［9］的研究还检测到3例AD表型分别携带40、45和58个重复，介于致病重复66的最小大小和正常大小38 之间。事实上，这些中间重复序列的致病性尚不清楚，需要来自不同种族的大量队列才能确定致病性重复序列和正常重复序列的大小。

4.3 特发性震颤 特发性震颤（essential tremor，ET）是成人常见的运动障碍疾病［19］，其特征为双侧上肢孤立的姿势和（或）运动性震颤，伴或不伴其他部位（如头部、声音或下肢）的震颤。ADELING 等［20-21］对462 例ET 患者进行研究，在4 例散发性ET 患者中发现GGC 重复扩增＞80 个单位，提示NOTCH2NLC GGC 重复扩增可与散发性ET 相关，纯ET 表型的携带者有可能会在最初震颤开始后40 a 内转为NIID。NOTCH2NLC扩增在临床特征良好的ET家系中仍然很少见。对于出现纯ET表型的NIID患者，需要高度怀疑和长期随访。NOTCH2NLC（Hg38）的参考序列包含11个GGC重复序列，中间有两个GGA三核苷酸［（GGC）9（GGA）2（GGC）2］。当比较扩增阳性ET 患者和9例NOTCH2NLC GGC扩增阴性的NIID患者之间的三核苷酸中断数据时，观察到ET的GGA重复中断频率（1.0%）低于NIID 患者（1.6%）。SUN 等［22］也观察到，NOTCH2NLC 基因5’非翻译区GGC 重复序列的异常扩增与ET 有关。与NIID 相比，家族性ET病例中GGA 中断的频率要低得多，GGC 频率明显高于NIID，且GGC 重复扩增异常的先证者震颤表型较重，日常生活活动能力较低，但差异统计学无意义，可能是因患者数量较少［23］。然而，一项对欧洲人ET患病率与NOTCH2NLC 基因中GGC 重复扩增进行的研究，却并未发现任何在NOTCH2NLC 基因中携带GGC 重复扩增的患者。NOTCH2NLC 基因中异常的GGC 重复扩增导致不同表型，GGC 重复大小和不同的重复中断是否在这些表型中起重要作用尚不清楚，这些都有待于进一步研究［24］。

4.4 帕金森病 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二大常见的神经退行性疾病，以黑质多巴胺能神经元进行性变性和路易体形成为特征。PD 患者表现出运动症状，包括运动迟缓、静止性震颤、肌张力增高和姿势不稳［25］。一项研究利用DLL1 缺失小鼠，发现Notch 信号在中脑多巴胺能神经前体细胞（neural progenitor cells，NPC）的分化和扩增过程中起着重要的调节作用，在DLL1缺陷小鼠的中脑或在使用Notch信号抑制剂治疗后，观察到神经元过早分化。在分化早期，Notch信号减弱导致神经前体细胞减少，多巴胺能神经元数量增加，并伴随着顺序连接的多巴胺能神经前体细胞（Msx1/2+，Ngn2+，Nurr1+）比例的动态变化，这些分化效应导致产生的多巴胺能神经元数量显著减少［26］。

MA等［27］对1 000例散发性PD患者，用聚合酶链反应试验筛选NOTCH2NLC GGC扩增重复序列的存在，并用长读基因组测序验证代表性样本。其结果发现，携带致病性NOTCH2NLC GGC 41～64 个重复序列的扩增的散发性PD 病患者可以出现典型的帕金森病，PD患者GGC 扩张期内无GGA 中断，AGC 中断频率明显高于NIID患者。这部分患者对低剂量左旋多巴反应良好，不出现药物相关的并发症。在几年的随访后也未表现出NIID的其他临床或影像学特征。临床NIID 病例报告有＞65 个重复。41～64 个重复序列的扩展可能构成PD的遗传风险，或代表不同的关联。这种中间重复范围是否代表一种具有随后临床表现潜力的内表型仍是推测的。另外，对1 011 例患有PD 的汉族人进行的一项研究发现，中间长度的NOTCH2NLC GGC 重复序列扩增在PD 中的作用，与报道的NIID患者相比，队列中中等长度重复序列阳性PD 患者的GGC 重复数显著增加，GGA/AGC 重复数的中断数明显减少，且GGC 重复扩增与成纤维细胞中NOTCH2NLC 表达的改变和自噬功能障碍有关［28］。然而，WAI等［29］的研究表明，运动障碍在白人NOTCH2NLC 中GGC 重复扩增的频率较低，且NOTCH2NLC 中GGC 重复序列重复扩展是ET 的遗传因素还是NIID表型谱中的一个亚型仍不确定。

4.5 NOTCH2NLC基因序列扩增与MSA的关系

多系统萎缩（multiple system atrophy，MSA）也是一种神经退行性疾病，其特征是各种症状的组合，如帕金森病、自主神经功能障碍和小脑性共济失调［30］。最近的一项研究报告了MSA 中GGC 重复序列扩增的阳性结果［31］。XU等［32］在中国人群中对328例散发性MSA患者进行了NOTCH2NLC基因GGC重复序列的筛查。然而，并未发现任何MSA患者NOTCH2NLC基因的GGC重复突变。MSA被广泛认为是一种散发性疾病，这使得识别MSA 的潜在致病基因变得困难。此外，NIID临床症状有广泛的异质性，包括认知功能障碍、帕金森病样行为、周围神经病变、共济失调、震颤、不自主运动、肌肉无力、发作和无力、癫痫发作和头痛［33-34］。其中一些症状似乎与MSA 重叠，几乎所有的MSA 患者都有显著的自主神经功能障碍，而在被诊断为NIID的成年人中，最常见的症状是认知能力下降和痴呆［35-36］。因此，对于MRI显示病程较长、痴呆和白质脑病的MSA患者，进行额外的皮肤活检和基因筛查，以评估NIID的可能性。

神经变性疾病的发病机制十分复杂。Notch 信号通路具有可以促进干细胞增殖分化、改变小胶质细胞极化、阻止少突胶质细胞分化和髓鞘的再生等多项功能，其调节功能的改变可能参与许多神经变性疾病的生理病理过程，NOTCH2NL作为Notch信号和神经发生的特异性修饰物，可以激活Notch信号通路，可能与许多神经退行性疾病密切相关，目前国内外已经开展了许多相关研究，NOTCH2NLC基因相关疾病具有高度复杂性和异质性，GGC 异常扩增表达可引起不同临床表型的机制仍然不清楚，其GGC 重复序列数量是否发挥重要作用亦不清楚，其具体分子学机制仍需大量基础研究的证实。深入研究NOTCH2NL 及NOTCH2NLC 基因在神经变性疾病的作用机制，可以为神经退行性疾病的发病机制提供更多的理论依据，为寻找潜在的治疗靶点提供新的思路，具有其重要的临床意义。