CAR-T疗法在肝癌中的研究进展

葛震，吴远博，毛琦淇，李宏

作者单位：315211宁波，宁波大学医学院（葛震、吴远博）；宁波市医疗中心李惠利医院（毛琦淇、李宏）

近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法发展迅速，特别是在血液恶性肿瘤的治疗中。CAR-T指将患者自身外周血中T细胞分离出来并采集，然后将可与肿瘤相关抗原（TAA）识别的单链抗体片段（scFv）通过病毒等载体转导至T细胞并利用MLV逆转录病毒和piggy Bac转座子等特殊的载体设计将其整合于细胞内基因组中，使T细胞表面表达嵌合抗原受（CAR）。CAR-T细胞与TAA识别并结合后，诱导了构象变化，通过TCR/CD3的 链或Fc RI的 链向T细胞传递活化信号和共刺激信号，导致细胞因子释放和转录因子表达，最终引起对肿瘤细胞的细胞毒性反应[1]。本文针对目前CAR-T在肝癌中的应用现况，讨论了目前的障碍和可能的解决方案，并描述了提高CAR-T细胞对HCC患者疗效的潜在策略。

1 CAR-T的发展历程

CAR主要由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区主要是由能以非MHC限制性的方式直接识别TAA的单克隆抗体轻链、重链可变区序列（scFv）（如CD19sc Fv、CD33sc Fv等）和铰链组成，连接到跨膜结构域上；跨膜区主要是I型二聚体跨膜蛋白，如CD4、CD8、CD28[2]。胞内区是免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM），通常是TCR/CD3和Fc RI，当胞外区与TAA结合后，向T细胞传递活化信号和共刺激信号。

数年来，CAR分子结构不断优化，到目前为止，CAR分子已经发展到了第四代。第一代的CAR只含有一个胞内信号激活受体CD3，由于缺少共刺激分子，不能转导增殖信号和诱导细胞因子产生，无法有效地实现CAR-T细胞在体内的持续的增殖。第二代CAR细胞内增加了一个共刺激分子，如CD28、CD27、41BB（CD137）、OX40（CD134）或者可诱导共刺激分子（ICOS），即便没有外源性共刺激分子，T细胞也能持续增殖并释放细胞因子。Milone等[3]使用二代CAR-T细胞在急性前B-淋巴细胞白血病小鼠体内进行实验，发现拥有共刺激分子的二代CAR-T细胞能持续增殖且活性增强。相比于二代CAR-T细胞，三代细胞内加入了两个共刺激分子，进一步增强细胞因子的分泌并抑制肿瘤生长。第四代CAR分子在二、三代分子结构的基础上整合表达免疫因子或共刺激因子配体（如IL-12），一旦与靶抗原结合，激活下游转录因子（NFAT）来诱导表达IL-12，从而招募环境中的其他免疫细胞，参与对不表达靶抗原的肿瘤细胞的清除；同时，被募集在肿瘤附近的免疫细胞还可以通过分泌某些细胞因子（如IFN-、TNF-、IL-4和IL-5等）来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，通过调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用[4]。

CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤中的应用取得了惊人的疗效，特别是特异性靶向CD19分子的CAR-T（CD19-CAR-T）细胞。临床研究表明其对晚期复发难治性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗有效率可达到90%，对慢性淋巴细胞白血病（CLL）和部分B细胞淋巴瘤的有效率＞50%[5]。2017年8月30日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了美国诺华公司用于治疗血液系统肿瘤的CAR-T疗法药物Kymriah，这一药物的上市，激发了研究者对CAR-T治疗拓展应用于实体瘤的研究热情。

2 CAR-T细胞治疗肝癌的靶点

2.1 Glypican-3（GPC3）GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，可能在细胞分裂控制和生长调节中发挥重要作用。肿瘤细胞中更高的GPC3表达与肝癌预后较差有关。GPC3在HCC和其他肿瘤类型中高表达，同时在正常组织中无法检测到它[6]。

Zhu等[7]在晚期HCC患者中使用GC33（一项选择性靶向GPC3的重组完全人源化单克隆抗体），表明GC33对GPC3高表达组具有抗肿瘤活性，且在所有剂量水平上，GC33都具有良好的耐受性，为选择性靶向GPC3提供了依据。Jiang等[8]将GPC3-CAR-T细胞移植到患者来源的三组HCC异种移植（PDX）模型中，评价了体内GPC3-CAR-T细胞的细胞毒性。结果表明GPC3-CAR-T细胞消除了PDX1组和PDX2组中的肿瘤细胞且有效抑制了PDX3组中的肿瘤生长，证明GPC3-CAR-T细胞能够有效地抑制体内原发性GPC3+HCC的生长。Shi等[9]进行了两项前瞻性I期研究，让患有晚期GPC3+HCC的成年患者（Child-Pugh A级）接受自体GPC3-CAR-T细胞疗法，13例患者的中位OS为278天。研究还进行了不良反应的评估，9例患者中观察到细胞因子释放综合征（CRS），其中8名受试者发生了自限性的低级CRS（1级或2级），没有患者发生3/4级神经毒性和CAR-T细胞相关的输注反应，证明GPC3-CAR-T细胞临床安全性较高。也有研究表明，抗GPC3和EGFR双靶向CAR-T细胞在体外对GPC3+EGFR+HCC细胞产生细胞毒性，而且其产生的细胞因子较单靶向T细胞更强，同时在体内抑制肿瘤增殖也较抗GPC3-CAR-T细胞更强，为抗GPC3-CAR-T细胞联合其他靶向研制药物提供依据[10]。

2.2 甲胎蛋白（AFP）AFP具有一系列重要的生理功能，包括转运功能、免疫抑制、诱导凋亡等[11]。胎儿的血清AFP浓度很高，但成人很低。然而，当成人发生肝细胞癌、肝母细胞瘤和畸胎瘤时，AFP会重新表达，因此可作为肿瘤诊断和疗效监测的血清标志物。传统的CAR-T细胞只能识别肿瘤表面抗原，而不能识别细胞内或分泌的抗原。考虑到所有细胞内或分泌的蛋白质都被加工成肽，并由肿瘤细胞表面的I类MHCs呈递，Liu等[12]构建的AFP-CAR-T细胞可以选择性地与HLA-A*02∶01呈递的AFP 158-166肽结合，然后脱颗粒，释放细胞因子，裂解HLA-a*02∶01+/AFP+肿瘤细胞。此外，在HCC异种移植模型和播散性腹膜肝癌模型中，发现AFP-CAR-T细胞能够成功抑制肿瘤的生长。与此同时，他们进行了一项I期临床试验，成功评估了表达AFP的HCC患者体内CART细胞的安全性和有效性（NCT03349255）。因此，用CAR-T细胞靶向细胞内和分泌的肿瘤抗原产物是有希望的癌症治疗策略。

2.3 CD147 研究表明CD147促进了HCC细胞的增殖、侵袭和转移，并有潜力用作肿瘤的重要预后和治疗生物标志物。目前已开发碘-131标记的CD147特异性单克隆抗体，可显著延长肿瘤复发中位时间[13]。因此针对CD147的靶向治疗可能为HCC提供一种有效的治疗策略。

Zhang等[14]开发出一种由Tet-On系统控制的经修饰的新型诱导型CAR-T细胞，能够在存在或去除多西环素（Dox）时可逆地开启或关闭CAR基因表达。当发生严重不良事件时，可以立即终止Dox的供应，在这种情况下，T细胞上CD147-CAR的表达将在24～48h内恢复到基线水平。在体外实验中，（Dox+）Tet-CD147-CAR-T细胞与（Dox－）Tet-CD147-CAR-T细胞和外周血单个核细胞相比，表现出更高的细胞毒性和增加的细胞因子分泌；同时，Tet-CD147-CART细胞对HCC细胞显示出显著的细胞毒性，还可以释放多种免疫刺激性细胞因子来增强抗肿瘤作用。进一步他们在体内进行了Tet-CD147-CART细胞抗肿瘤活性的实验，结果表明在有DOX存在时，CD147-CART细胞可以有效杀死癌细胞的HCC异种移植物模型。提示CD147-CAR-T细胞可能可以为肝癌患者临床药物提供治疗选择。

2.4 CD133 CD133是在各种实体瘤中过表达的五聚糖跨膜糖蛋白，在50%的HCC高表达。Kohg等[15]报道称，CD133细胞只存在于肝癌组织中，而不存在于非癌肝组织中，并且CD133在肝癌细胞中的表达可能诱导肝癌细胞的生长和转移，CD133的高表达通常与较高阶段的癌症等级、较差的患者预后相关联。此外，CD133已被证实是参与癌症干细胞和内皮祖细胞肿瘤转移和复发的标志物[16]。在一项I期临床试验中，接受CD133-CAR-T治疗的HCC患者中位生存期为7个月，明显高于一线治疗无效的晚期HCC患者（4个月）。CD133-CAR-T重复输注后，可使无法对一线治疗产生反应的患者获得相对较长的稳定期，同时通过重复注射能够有效改善CAR-T细胞治疗的持久性，使CD133-CAR-T细胞可以在体内长期生存，而CAR基因的持久性也可以有效实现疾病清除和防止复发的作用。在II期临床试验中，CD133-CAR-T细胞在晚期HCC中具有较好的抗肿瘤活性和可控的安全性。该研究结果表明总生存期的中位数为12个月，无进展生存期的中位数为6.8个月[17]。

2.5 c-Met c-Met是一种由MET原癌基因编码的酪氨酸激酶受体，它具有高亲和力配体-肝细胞生长因子（HGF）。HGF诱导c-Met二聚化激活，从而刺激多个下游信号通路，包括促分裂原激活的蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶以及核因子kappa-B，导致一系列生物学效应，如细胞生长、增殖、侵袭及迁移等[18]。c-Met/HGF信号抑制剂能减少肝细胞肿瘤细胞的增殖，细胞运动性和侵袭性，并促进凋亡，已在HCC临床前模型中显示出抗肿瘤潜力，c-Met抑制剂在HCC的治疗中也显示出疗效，尤其是对c-Met阳性肿瘤的治疗。同时，临床及临床前试验已有部分非选择性c-Met抑制剂来治疗HCC[19]。因此c-Met被认为是治疗HCC的一个潜在靶点。

Liu等[20]研究c-Met-CARNK细胞在体内表现出对人肝癌HepG2细胞具有细胞毒性作用。近期研究也表明，双特异性c-Met/PD-L1 CAR-T细胞可以通过在体外对HCC细胞显示出优异的细胞裂解能力，产生更多杀伤HCC细胞的细胞因子和更加显著的抑制小鼠体内HepG2异种移植物的肿瘤生长[21]。

2.6 PD-1 程序性死亡受体1（PD-1），也称为CD279，是一种重要的免疫抑制分子。通过下调免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受[22]。在肿瘤的发展和生长过程中，肝微环境中有效的抗肿瘤免疫监视受到损害，而PD-1/PD-L1信号通路，参与了上述过程[23]。在HCC患者中，PD-1在CD8+T细胞中的表达增加；此外，在肝癌患者中高表达PD-1与肿瘤浸润淋巴细胞和衰竭表型相关。2017年9月，Nivolumab被FDA批准用于在索拉非尼失败后的肝癌二线治疗的抗PD-1单克隆抗体。尽管部分患者的临床结局有所改善，但抗PD-1/PD-L1抑制剂在80%的HCC患者中仍然无效。此外，它们价格昂贵并且引起许多严重的副作用[24]。因此，针对PD-1为靶点的药物兹待开发。

Pan等[25]研制出携带PD-1-CH3融合蛋白（sPD1）的GPC3特异性CAR-T细胞，并证实其可以特异性识别、裂解的GPC3阳性HCC细胞，同时在体内实验中显示出比GPC3-CAR-T细胞更高的肿瘤抑制能力。与此同时，GPC3-28Z-sPD1 T细胞治疗的小鼠中观察到肿瘤中CD3阳性T细胞的数量增加，颗粒酶B水平升高和Ki67表达水平降低。这些数据共同表明，携带sPD1的GPC3特异性CART细胞显示出有望用于治疗HCC患者。近期研究表明，PD-1的破坏增强了CART细胞对肝癌的体内抗肿瘤活性，改善了带有肿瘤的小鼠中CAR-T细胞的持久性和浸润性，并增强了GPC3-CAR-T细胞在异种移植肿瘤中对肿瘤相关蛋白基因表达的抑制作用，也显示出PD-1对CAR-T细胞中的应用有巨大作用[26]。

3 CAR-T细胞治疗肝癌所面临的困难及策略

3.1 肿瘤特异性抗原的缺乏 CAR-T细胞治疗HCC成功的障碍之一是难以找到理想的肿瘤相关抗原（TAA）。尽管针对HCC的靶点有很多，例如AFP、CD147及GPC3等，但其特异性不强。此外，由于肿瘤组织异质性这一特点导致不同转移部位的肿瘤即使亚型相同遗传类型也不同，造成了CAR-T疗效不佳。由于这些靶点的表达不同，单一的CAR-T治疗策略可能并不适用于所有HCC患者。此外，TAA不仅在癌细胞中表达，而且在正常细胞中也以低水平表达，因此在健康组织中引起靶向、肿瘤外毒性。目前，T细胞工程中主要应用了3种类型的双特异性CAR，即双靶CAR、串联CAR和通用CAR。通过使用两个或多个细胞外抗原识别基序设计特异性更强的CAR-T细胞来增强CAR-T结合实体瘤靶点的有效性。Kloss等[27]首先报道了一种带有嵌合共刺激受体（CCR）的次优CAR细胞（前列腺特异性膜抗原PSMA和前列腺干细胞抗原PSCA），只有当这两种靶抗原同时出现在肿瘤细胞表面时，双T细胞才会被完全激活，并杀死了表达这两种抗原的细胞，从而显著增强特异性，使正常细胞不受影响。

3.2 T细胞活性维持时间短 CAR-T在各种实体瘤患者体内的活化维持时间从22d到9个月不等[28]，维持时间短，影响患者预后。选用特定亚型的T细胞用于编辑CAR-T细胞，如幼稚性T细胞（表达CD62L），与效应T细胞相比，此种CAR-T细胞具有更强的在患者体内持续存在的能力[29]。

另一种用于延长CAR-T在体内的活化时间的方法是通过敲除T细胞内的特定基因。锌指（TALEN）技术被用来永久性地删除T细胞中TCRa和b的表达[30]。这些T细胞通过CAR而非TCR定向刺激对CD19抗原产生应答，这表明同种异体的CAR-T细胞并不会产生移植物抗宿主病，这是向产生通用供体T细胞方向迈出的重要一步。因此，无论供体来源如何，都有可能产生具有最佳移植效果的T细胞库，从而规避个性化患者产品固有的可变性。

3.3 CAR-T细胞归巢 CAR-T细胞向肿瘤部位高效迁移从而直接与肿瘤细胞结合是CAR-T细胞疗法成功的关键。趋化因子在淋巴细胞迁移中起主要作用，如CXCR2、CXCR3和CCR5。因此，可将肿瘤组织高表达的趋化因子相应受体整合于CAR-T细胞中作为靶点。这种方法最初是通过趋化因子受体CXCR2在T细胞中的表达来证明的，CXCR2对黑色素瘤肿瘤细胞产生的趋化因子CXCL1（Groa）具有特异性[31]。Moon等[32]运用痘苗病毒在小鼠间皮瘤模型中瘤内递送趋化因子CXCL11时，发现CAR-T浸润水平和抗肿瘤效果显著增加。Smith等[33]研究表明与全身给药相比，局部注射需要的细胞数量更少、毒性反应更低。趋化因子系统是复杂的，因此，为了有效靶向CAR-T细胞，需要了解肿瘤产生的一系列趋化因子的组合效应，以制定一种策略，专注于重要的归巢趋化因子，避免其他肿瘤表达的趋化因子的潜在调控作用。

3.4 肿瘤微环境的免疫抑制 肿瘤微环境具有氧化应激、营养耗竭、酸性pH环境和缺氧等特性，可降低CAR-T细胞活性。Juillerat等[34]发现共表达缺氧诱导因子的CAR-T细胞可在肿瘤微环境中获得更强的活性，在体外正常氧水平下该种CAR表达低下，但在低氧条件下CAR表达水平显著提高。IL-12的产生与CAR活性密切相关，共表达IL-12的CAR-T细胞能保证IL-12在肿瘤微环境中局部产生，影响了肿瘤基质内的局部抑制细胞，诱导了巨噬细胞活性，导致对癌症的免疫攻击范围扩大，包括对CAR靶抗原表达缺失的肿瘤细胞的攻击[35]。

3.5 不良反应 CAR-T细胞治疗过程中产生的严重不良反应也是应用于实体肿瘤的主要挑战，例如急性呼吸窘迫综合征、CRS及严重神经毒性（SNT）等。CAR-T细胞治疗的毒性增加主要有两种机制：（1）CAR-T细胞免疫治疗后最危及生命的毒性是靶向毒性，如CRS。CART细胞与靶肿瘤细胞上的抗原结合后被广泛激活，导致大量炎性细胞因子的释放。CRS症状包括发烧、疲劳、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、谵妄、幻觉及低血压，甚至严重的多器官衰竭。其严重程度与肿瘤负荷密切相关。IL-6似乎是CRS的主要调节因子，因此改善这一副作用的关键策略是直接用IL-6R抑制剂tocilizumab阻断IL-6；（2）另一种类型的毒性来自CART细胞与正常细胞的靶抗原结合，导致健康细胞和器官的破坏。例如，在神经母细胞瘤的治疗中，GD2特异性CAR-T细胞治疗存在致命的神经毒性，提示GD2可能是CAR-T细胞治疗的不合适的靶向抗原。为了降低这种毒性的风险，提高CAR-T细胞靶抗原特异性显得尤为重要，如上文中提及的双靶CAR-T细胞。

4 总结与展望

尽管CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤取得了令人印象深刻的成果，但想要实现实体瘤的可靠治愈，CAR-T细胞的研究和应用要还有很长的路要走，尤其是HCC。如本文所提许多有希望的针对HCC的CAR-T细胞治疗策略已经在临床前模型中实施，并显示出有希望的结果。CAR-T在临床前和临床研究中均被证明是一种有前途的HCC治疗方法。进一步优化CAR的设计，以提供更好的T细胞活化、识别特异性、抗肿瘤活性和安全性控制。寻找最佳信号和共刺激域继续提高CAR-T治疗的疗效。应用双靶CAR提高肿瘤细胞识别特异性，限制对正常细胞的意外攻击。克服免疫抑制肿瘤微环境，对CAR修饰的T细胞进行更多的修饰（IL12、PD1、CTLA4）。建立标准的临床方案，包括患者预处理、细胞因子支持和其他潜在的联合治疗。随着这些技术难题的不断突破，相信CAR-T将会在实体瘤的治疗中获得更好的效果。