动脉粥样硬化中的内皮细胞向间质转分化及细胞反应的分子机制研究进展

陈航，郑江华

(川北医学院附属医院血管外科，四川 南充 637000)

0 引言

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) 是一种严重危害人类健康的常见病，是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等心脑血管疾病发生的共同基础，是引起心脑血管疾病死亡的重要因素。AS 是一种炎症相关性疾病，它会导致动脉壁硬化和增厚，并形成由免疫细胞、平滑肌细胞、脂质、成纤维、间充质细胞、细胞外基质组成的斑块。动脉粥样斑块中的间充质细胞的来源一直在研究，目前的研究表明内皮细胞是斑块内间充质细胞的来源。内皮细胞向间质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)被认为是上皮间质转分化的一种亚型，是指内皮细胞失去其自身特性而获得间质细胞特性的表型转变过程。本文综述EndMT 在AS 的证据、危险因素、生化信号通路以及细胞反应的分子机制。

1 EndMT 在AS 的证据

EndMT 改变包括细胞形态变化、增殖和迁移能力增强、分泌胶原蛋白和纤维连接蛋白等细胞外基质及表达一些白细胞黏附分子，而发生间质转分化的内皮细胞可以从铺路石样形态转变成分散的纺锤[1]。氧化应激、缺氧、振荡剪切应力、炎症等促动脉粥样硬化因素都可以导致EndMT 的发生。在动脉粥样硬化斑块部位存在明显的氧化应激，并且内膜斑块部位的氧化应激程度比外膜更为明显。近年研究表明EndMT 也是动脉粥样硬化的重要病理过程[2]。成纤维细胞可以调节炎症、细胞外基质和胶原蛋白的产生以及斑块的稳定性，在动脉粥样硬化病变过程中占有重要地位。研究发现，在动脉粥样硬化斑块中存在EndMT 来源的具有成纤维细胞特征的细胞。载脂蛋白E 基因被敲除的小鼠中，采用黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein，YFP)标记内皮细细胞，在胸主动脉斑块进行检测发现 YFP 阳性的内皮细胞同时表达大量的成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein，FAP)[3]。而正常的内皮细胞并不表达FAP，说明斑块内确实发生了EndMT。此外在靠近脂质核心的部位，EndMT 的程度更大，内皮细胞来源的间质细胞表现出更为成熟的成纤维细胞表型；进一步研究发现，发生粥样硬化的动脉外膜也存在EndMT。更重要的是，人动脉硬化斑块部位也存在同时表达内皮细胞和间质细胞标志分子的“转化”细胞，表明动脉粥样硬化过程中确实发生了EndMT。EndMT也被认为与斑块不稳定性有关[4]。同时一系列信号通路也被认为参与了EndMT 的过程。

2 在AS 中促进EndMT 的危险因素

2.1 切应力对EndMT 的影响

切应力是血液流向与内皮细胞相切时所施加的摩擦力，而内皮细胞对切应力极为敏感。内皮细胞通过将机械刺激转化为生化信号的多种机械感觉复合体来感知切应力[5]。血流紊乱的特征是在分叉点和弯曲处的低而振荡的切应力(Low and Oscillatory Shear Stress，LOSS) 的产生，进而诱导斑块的形成。LOSS 通过产生活性氧来增强内皮细胞的氧化应激[6]。内皮细胞中高水平的活性氧导致形态学改变和EndMT 标志物的诱导，同时内皮基因表达下调[1]，这些提示LOSS 来源的氧化应激诱导EndMT。此外，LOSS 还会促进血管炎症、内皮细胞增殖、凋亡和衰老，从而增加血管通透性，从而促进动脉粥样硬化的发展[7]，说明LOSS 诱导的EndMT 可能参与了这些内皮细胞功能的改变。此外，LOSS 使单核细胞重新聚集到内皮细胞，促进M1 型泡沫细胞分化，然后分泌CCL4、白介素-1(Interleukin-1，IL-1)β 和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)α。CCL4 可 通 过 增 加 内 皮细胞内源性转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)β 的表达而诱导EndMT[8]，提示内皮细胞与泡沫细胞之间的相互作用在诱导EndMT 中起重要作用。

2.2 循环应变对EndMT 的影响

循环应变(cyclic strain，CS)是血压派生的力，由于血流的脉动导致动脉壁在垂直于内皮细胞的圆周方向反复变形。生理水平的CS 通过PLK3 激酶介导的AKT 促进内皮细胞的迁移和增殖[9]，而CS 水平的升高(＞15%)则会诱导内皮细胞表达基质 金 属 蛋 白 酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，如MMP-9[10,11]。内皮细胞通过Notch 信号通路激活EndMT 转录程序来表达MMP-9[12]，提示动脉粥样硬化中CS 水平升高可能会加重EndMT。而病理性CS 会诱导线粒体活性氧释放，随后激活NF-κB 信号[13]。由此产生的氧化应激和炎症状态通过增加TGF-β 的表达并通过ALK5 激活其信号通路来促进EndMT[14]。

2.3 氧化低密度脂蛋白对EndMT 的诱导

动脉粥样硬化的特征是血脂异常，如氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)水平的升高。ox-LDL 被证明可以加速诱导EndMT[15]，且ox-LDL 的这种诱导作用严格依赖于其固有的膜受体LOX1[16]。后经研究证明，一个触发EndMT 的关键转录因子-snail，被ox-LDL 特异性地上调了转录，并且它的敲除完全减弱了ox-LDL 诱导的EndMT，这表明它在调节这一效应中发挥了重要作用[16]。

2.4 高血压和高血糖对EndMT 的影响

高血压和高血糖时，内皮素(Endothelin，ET)-1、纤溶酶原激活物抑制物(Plasminogen activator inhibitor，PAI)-1 和血管紧张素(Angiotensinogen，Ang)-II 通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)诱导内皮细胞TGF(transforminggrowthfactor，TGF)-β的表达[17,18]。高血压时，内皮细胞Smad2 活性增加，表明TGF-β 信号通过碱性磷酸酶激活[19]。进而表明EndMT 中，这种TGF-β 活性的增加与内皮细胞表达间充质标志蛋白(如α、FSP1、SMA 和I 型胶原)有关[20,21]。

综上所述，LOSS 诱导动脉粥样硬化区域的EndMT 已经变得很明显，然而将切应力与EndMT激活联系起来的确切机制还需要进一步阐明。现在需要进一步的工作来确定，在何种程度上LOSS诱导的EndMT 会导致内皮细胞功能障碍，从而导致局灶性动脉粥样硬化，并确定其潜在的机制。对于CS 来说，内皮细胞动态平衡高度依赖于CS，在生理水平上维持动态平衡，在病理水平上激活多个诱导EndMT 的信号反应。因此，内皮细胞和CS 之间的相互作用很可能促进了动脉粥样硬化的局灶性发展。对于可促进动脉粥样硬化的危险因素来说，促进动脉粥样硬化的危险因素可通过多个信号途径促进EndMT，这些都涉及氧化应激诱导的表达和TGF-β 信号的激活。拮抗与动脉粥样硬化危险因素相关的信号紊乱，可能会抑制EndMT 和动脉粥样硬化的进展。

3 EndMT 中的生化信号及细胞反应机制

近年来研究表明，EndMT 为动脉粥样硬化的发展影响甚深，然而，引起EndMT 的信号机制却知之甚少。TGF-β、Notch、Wnt、FGF 等信号通路或细胞因子可直接或间接介导EndMT[3,21]。

3.1 EndMT 和TGF-β 信号通路

TGF-β 超家族包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形态发生成蛋白等[22]，都参与调节EndMT标志物基因的表达。研究表明，虽然TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 都能诱导间充质标志物的表达，但 是TGF-β2 比TGF-β1 和TGF-β3 更 能 诱导间充质标志物，从而促进EndMT[23,24]。而在内皮细胞中，激活素受体样激酶(Activin receptor like kinase，ALK)1 和ALK5 是主要的TGF-β1 受体[25]。TGF-β 与碱性磷酸酶结合后，激活Smad1和Smad5(即磷酸化)，促进血管内皮细胞增殖和血管生成[26,27]。相反，TGF-β 与ALK5 结合可诱导 Smad2 和Smad3 的激活，从而抑制内皮细胞增殖，促 进EndMT[27,28]。有 趣 的 是，TGF-β 激 活ALK1去拮抗ALK5 的活性[25,27]，这可能解释内皮细胞对TGF-β 刺激的多效性反应，并提示TGF-β 信号在血管内稳态信号转导中的微妙平衡。Snail 和slug是重要的EndMT 诱导剂，它们通过调节几种与EndMT 相关的蛋白[如血管内皮钙粘蛋白(Vascular endothelialcadherin，VE-cadherin) 和 钙 粘 附 蛋白(cadherin)E]来获得间充质表型，而VE-cadherin和E-cadherin 是内皮细胞与细胞粘附所必需的[29]。有研究证实，TGF-β1 上调Snail 和Slug 的表达，会促使人体冠状动脉内皮细胞失去细胞间连接，这提示TGF-β1/Smads/Snail/Slug 通路参与了人体冠状动脉内皮细胞的EndMT 过程[30]。虽然Snail 或Slug 的内皮缺陷可阻断TGF-β 诱导的EndMT，但Snail 或Slug 单独过表达不足以诱导EndMT，提示EndMT 诱导过程中各因子之间存在协同作用[31,32]。

3.2 EndMT 和Wnt/β-catenin 信号通路

在心脏瓣膜发育过程中，Wnt/β-catenin 信号对 于EndMT 是 必 不 可 少 的[33,34]。Wnt/β-catenin可以通过抑制GSK3β 来稳定snail，使EndMT 升高，但Wnt/β-catenin 信号也可直接诱导EndMT[32,35]。事实上，Wnt3a 诱导的内皮细胞中间充质蛋白的表达可以被Wnt 抑制剂DKK1 抑制[36,37]。相反，通过Wnt7a 发出的信号会抑制EndMT[38]。

3.3 EndMT 和Notch 信号通路

在发育过程中，Notch 信号通过激活间充质基因表达来促进心内膜EndMT[39,40]。Noch 信号通路可以直接激活Twist1 的表达[41]，并在包括Slug 在内的多种间充质基因的启动子中促进Smad3 向SBE 的募集[42]。此外，Jagge-1 诱导的Notch 信号的激活导致间充质转录因子RUNX3 的核积聚，从而诱导几个间充质基因的表达[43,44]。

3.4 EndMT 和FGF 信号通路

有研究表明，EndMT 的程度与动脉粥样硬化的程度密切相关，与成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)1 的 表达呈负相关，有趣的是，与动脉粥样硬化抵抗区相比，动脉粥样硬化易发部位(DSS 区)的FGFR1 染色水平较低，这表明DSS 下调了FGFR1 的表达[3]。此外，高切应力保护完全丧失，导致正常动脉粥样硬化抵抗区域形成斑块，从而进一步将高切和成纤维生长因子(FGF)信号的抗动脉粥样硬化作用与EndMT 和动脉粥样硬化联系起来。同时，炎性细胞因子也调节FGFR1 的表达：体外培养的原代内皮细胞暴露于IL-1β、TNF-α 和IL6 可降低FGFR1的表达。重要的是，虽然每个单独的细胞因子都需要相对较高的剂量来抑制FGFR1 的表达，但两种或两种以上的组合在低得多的剂量下就能抑制FGFR1 的表达[3]。这些发现表明，抑制任何一种炎性细胞因子在治疗动脉粥样硬化方面都不太可能有效。

总之，EndMT 可以由各种信号机制诱导，但是这些机制是如何交叉沟通的，或者这些机制之间是否存在层级秩序，仍然难以捉摸。然而，导致EndMT 的大量途径表明，EndMT 在正常生理中起着重要作用，在疾病过程中可能会变得异常或加重。

4 总结

众所周知，内皮功能障碍在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键的启动作用。最近的研究表明，内皮细胞在动脉粥样硬化的发生和发展中还有另一个作用，即EndMT。EndMT 是内皮细胞失去其特征性标记蛋白的表达和细胞功能，而获得间质标记蛋白的表达，并具有间质细胞的功能的过程。在这里，我们回顾了诱导、调节或抑制EndMT 的主要生化和生物力学信号，且生化信号和生物力学信号结合在一起形成了一个复杂的信号网络。显然，天然血管结构通过生物力学信号决定动脉粥样硬化发展的风险区域[45]。在这些所谓的动脉粥样硬化区域，来自全身动脉粥样硬化危险因素(如炎症、高血糖、血脂异常)的生化信号诱导内皮功能障碍，如果持续，则开始诱导EndMT，从而促进动脉粥样硬化的进展。尽管目前发现一些常用的动脉粥样硬化常见防治药物对上皮间质转分化具有抑制作用，譬如他汀类药物[46,47]。其他潜在的具有抑制内皮间质转分化的药物包括了螺内酯和雷柏霉素等[48,49]。但是，明确动脉粥样硬化发生过程中EndMT 的发生机理，对疾病将有更多更有效的治疗方法，也会对动脉粥样硬化的机理提供新的思路和见解。