miR-675 在2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝中的 研究进展

刘璐，景洁，王家浩，刘菊香，权金星(通信作者*)

(1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000)

0 引言

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一组由遗传和环境因素引起的，导致胰岛功能下降，胰岛素敏感性逐渐恶化和胰腺胰岛素分泌减少，形成相对胰岛素缺乏的状态，导致高血糖，以慢性高血糖为主要特征的代谢性疾病，严重降低了人类的生活质量，预计到 2030 年将影响到5.784 亿人，成为全球最常见的致残的慢性疾病之一[1]。非酒精性脂肪肝已经发展成为全世界最常见的慢性肝病[2]，据最新研究报道，T2DM 中NAFLD 的患病率为 54.3%-64.9%[3]。一份来自22 个国家的850万人的最新研究表明，80%以上的人都是超重或者肥胖，72%的人有不正常的血脂，44%的人是2型糖尿病。非酒精性脂肪性肝病是一种与内脏脂肪和代谢综合征密切相关的肝损伤类型[4]，其亚型主要有非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎，成为肝硬化、肝癌的主要病因。非酒精性脂肪肝和2 型糖尿病之间相互作用，两者在病理生理机制上有密不可分的联系[5]。糖尿病合并脂肪肝的发生与高血糖、胰岛素抵抗和高脂血症等密切相关[6]。糖尿病患者在长期的高血糖状态下，血清中氧化应激产物及NF-κB、IL-6、IL-18 等炎症介质增加，从而影响脂类物质在血液与肝脏之间的交换和代谢[7]，同时炎症因子将炎症细胞募集到肝脏并通过线粒体增加活性氧应激并促进细胞死亡[8]。MicroRNAs(miRNAs，miRs) 是 一 类 长 约20-25 个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与靶基因的mRNA 的3’端非编码区(3’UTR)结合，促进靶基因mRNA 的降解或抑制蛋白的合成，负性调控靶基因的表达[9]。miRNA 可以在细胞外被检测到，包括在血液、尿液和其他体液中，它们的表达相对稳定[10]。越来越多的证据表明，miRNA 通过控制胰岛细胞功能、脂肪细胞胰岛素抵抗、肝细胞胰岛素信号、葡萄糖稳态，在调节葡萄糖和脂代谢中发挥作用，因此可能参与相关疾病的发病机制[11]。

1 目前非酒精性脂肪肝的诊断

非酒精性脂肪肝是一种异质性疾病，从组织学的角度可以分为非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。非酒精性脂肪肝是指有至少5%的肝脏脂肪变性，且没有肝细胞气球样变的迹象。非酒精性脂肪肝是指有至少5%的肝脏脂肪变性，伴或者不伴纤维化。从流行病学观点来看，NAFLD 中晚期阶段心血管的代谢危险升高，例如中晚期NASH 伴纤维化[12,13]。因此改进现有的诊断方法，并进一步发展具有创新性的、非侵入性工具来诊断这些不同阶段的疾病，是非常必要的。

临床实践中对于肝脏脂肪变性的诊断，超声的应用是非常广泛的，整体敏感性85%，特异94%，精确度较高[14]。但是和磁共振质子波普成像相比，肝脏超声检测肝脏脂肪变性的能力较差[15]，只有当肝脏脂肪含量达到至少12.5%时，肝脏超声才会有其高敏感度，约为80-85%[16]。磁共振质子波普成像价格高昂，较少用于临床。目前应用的肝脏脂肪变性的诊断指标中，广泛应用的脂肪肝指数的灵敏度为73%，特异度为74%[17]。计算机断层成像技术(CT)对于脂肪肝的诊断是非常精准的，但是由于射线的量比较大，较少应用于临床。目前采用各种非侵入性手段诊断非酒精性脂肪肝的关键是确定是否存在脂肪性肝炎，特别是中重度纤维化(至少F2 纤维化阶段)来衡量疾病的严重程度。血浆谷丙转氨酶(ALT)浓度升高并不能准确预测疾病的严重程度，即使血浆谷丙转氨酶浓度是正常上限的两倍(＞70 U/L)，也只能预测NASH，其敏感性为50%，特异性为61%[18]。所以，在评价肝脏疾病的本质和严重性方面，肝组织切片活检仍是最明确的检测方法。但是，由于组织切片的费用和可能出现的并发症，使人们对开发一种新的、无创的治疗方式产生了浓厚的兴趣[19]。

2 miR-675 参与NAFLD 的发生发展

2.1 miR-675 是由H19 的第一个外显子产生的，H19 是一种长链非编码RNA[20]，国内外研究发现，miR-675 在口腔癌[21]、乳腺癌[22]、胰腺导管细胞癌[23]、肝细胞癌[24]等恶性肿瘤中细胞中表达上调，通过多种途径参与肿瘤细胞的增殖与侵袭。高糖状态下，应用Targetscan 生物信息软件预测miR-675 的靶基因，进而用DAVID KEGG 分析，发现对预测的靶基因进行分类，从而识别miR-675 参与的通路，发现miR-675 参与了胰岛素信号通路、脂肪因子信号通路等[25]。VDR 是miR-675 的靶基因之一，H19/miR675/VDR/EGR1 的负反馈回路参与了DN 的发展[26]。

2.2 内脏脂肪组织的积累与代谢综合征风险增加相关，肝脏在调节脂质代谢和内稳态方面起着核心作用，而脂质代谢和胰岛素信号的破坏与NAFLD 密切相关。因此，确定控制脂质代谢和胰岛素抵抗的调控因子是至关重要的。心包脂肪沉积在心脏周围的两个位置:心外膜(EAT)和心旁脂肪组织，已被证实心外膜脂肪沉积与胰岛素抵抗、中心性肥胖存在正相关关系[27]，在该研究中miR-675 在高血糖期间在EAT 中显著上调[25]。高血糖状态下miR-675 的靶基因预测表明PCK-2 是miR-675 的靶点。PCK-2 编码了线粒体同工酶，与甘油发生有关，通过脂肪组织中的甘油三酯-脂肪酸循环影响脂肪酸的储存和调节释放。[28]甘油发生是糖异生的一种简化形式，即从丙酮酸、乳酸或丙氨酸等底物中产生甘油-3-磷酸，甘油生成在脂肪组织和肝脏中很重要，以维持甘油三酯-脂肪酸循环。甘油异生，像糖异生一样，是由PCK 活性调节的[29]。PCK 参与肝脏、脂肪组织甘油三酯的储存，可能在脂质储存调节中发挥重要作用。同时，有研究证实，小鼠肝脏过表达PCK-2 会导致胰岛素抵抗和2 型糖尿病[30]。

2.3 miR-675 参与人间充质干细胞脂肪形成过程中脂滴形成[31]，该研究通过RNA 分离和RNASeq分析筛选了95 种与脂滴形成的相关的miRNA，测定了人间充质干细胞7d、14d、21d、28d 的miRNA 水平的变化,发现miR-675 显著差异性上调，并用TargetScan 软件预测了其靶基因，主要靶向ACSL1( 长链脂酰COA 合成酶)、APOB( 载脂蛋白)、METTL7A( 甲基转移酶样蛋白7A)、PLIN1(人围脂滴蛋白1)和PLIN4(人围脂滴蛋白4)等，可能成为代谢综合征(如肥胖症、2 型糖尿病、脂肪变性、动脉粥样硬化和骨质疏松症)的生物标志物和治疗靶点。

2.4 NAFLD 的发病机制目前尚不清楚，遗传和环境均有影响，可以用“二次打击”假说解释，胰岛素抵抗始终是关键，第二次打击时，肝脏内过多的游离脂肪酸在线粒体内代谢时，产生大量氧活性自由基，氧化肝脏内的脂质成为脂质过氧化物。而氧自由基和游离脂肪酸同时也是动脉粥样硬化的高危因素[32]。miR-675 与超敏C 反应蛋白(CRP)在动脉粥样硬化患者中同时高表达，miR-675 成为动脉粥样硬化的重要预后标志物[33]。有文献报道，对动脉粥样硬化糖尿病大鼠的髂主动脉组织样本中鉴定728 种miRNA，其中的9 种miRNA 显著差异上调，包括miR675[34]。

2.5 miR-675 的前体长链非编码基因H19，通过miR-675/IGF-1 信号通路参与调控肝脏的发育成熟[20]。虽然凋亡和坏死都导致细胞死亡，但两者对周围组织微环境和随后的免疫反应的影响有明显不同[35,36]。与细胞凋亡不同，坏死是高度炎症性的，在该研究中发现miR-675 和H19 在肝硬化肝脏中升高，miR-675 靶向FADD 下调，增强了炎症信号下的肝脏坏死性凋亡，这种调节刺激和增强了肝脏的炎症反应[37]，已有研究表明，H19能增强NF-κB 的活化，从而促进细胞的存活和增殖[38]。该研究我们证明了H19 的这个功能至少可以部分归因于miR-675 的活性，通过miR-675处理后可增强体内几个NF-κB 靶基因的表达，特别是促炎细胞因子。该研究发现在注射了miR-675 的小鼠的肝脏中看到了巨噬细胞的募集。以上结果强烈表明，miR-675 通过增加 NF-κB 的激活来增强肝脏炎症。

2.6 lncRNAs 和miRNAs 均 参 与 调 节 了HBV 相关肝病[39], 刘青[40]等将HBx 转染到L02 细胞中后ALT、AST 升高从而构建肝细胞损伤模型，lncRNAH19 和miR-675 的表达显著上调，从而说明lncRNAH19 和miR-675 轴参与了HBV 相关的肝炎和肝细胞损伤。免疫反应因子，特别是促炎细胞因子，在HBV 诱导的肝损伤中发挥重要作用[41]。在本研究中，我们发现HBx 过表达显著提高了IFN-γ、IL-6 和IL-18 的产生，而抑制lncRNAH19 或miR-675 明显抑制了其升高，所以表明lncRNAH19/miR-675 轴调控了HBx 诱导的炎症因子。为了进一步研究H19/miR-675 轴在HBx 诱导的细胞损伤中的潜在分子机制，我们使用Miranda 和TargetScan 预测了miR-675 假定的靶基因，最终筛选PPARα 作为研究重点，该研究在随后的双荧光素酶报告证明miR-675 直接靶向PPARαmRNA 的3'-UTR。该研究对此进行了验证，在慢性乙型肝炎患者组织中PPARα 的表达显著下调，且lncRNA H19 的表达与PPARα或miR-675 与PPARα 呈负相关。这些结果提示H19/miR-675/PPARα 轴可能在慢性乙型肝炎中发挥重要作用。随后该研究又进一步证实了LncRNA H19/miR-675 /PPARα 轴通过Akt/mTOR信号调控乙型肝炎蛋白诱导的肝细胞损伤和能量代谢重塑。

3 小结

综上所述：miR-675 可能在2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的病理发生机制具有重要作用，miR-675 是一种具有潜力的新的治疗靶标，它可以从多个角度、多途径参与 NAFLD 的发病机理，从而为 NAFLD 的治疗提供新的方法和方法。但在此基础上，仍然存在着许多需要进一步解决的问题。比如，在动物试验中非常有效的miR-675 是否也能在人类身上产生同样的作用？是否可以在临床上推广？它是怎样在临床上使用的？miR-675 的研究是一个充满了未知与惊奇的过程，它的作用靶标和机理有待于进一步的深入探讨。