钙在氟骨症治疗中的应用及其作用机制研究进展

唐余敬，李光第，刘日光

1 贵州医科大学临床医学院，贵阳 550004；2 贵州医科大学附属医院骨科

长期接触大量氟化物会导致人体慢性氟中毒，引发全身多系统损害。以骨与关节损害为主的氟骨症是慢性氟中毒最突出的表现［1］。钙是组成人体骨骼和牙齿的重要成分，同时参与维持骨周转平衡［2］。过量氟化物可干扰人体骨的形成和吸收，破坏成骨细胞和破骨细胞介导的骨动态平衡，引发骨周转障碍，导致氟骨症［3］。既往研究发现，外源性摄入钙可有效拮抗氟毒性，对氟骨症具有一定治疗作用。近年来，钙在氟骨症治疗中的作用研究已经深入分子水平，主要集中在钙通过相应信号转导通路、逆转骨平衡相关基因蛋白的表达等。现就钙在氟骨症治疗中的应用及其作用机制最新研究进展综述如下。

采用TTC染色法测定各组大鼠的脑梗死体积。经神经功能学评分后断头处死各组大鼠，并将其大脑置于脑槽中，制备冠状切片（2 mm），置于2%TTC染色剂中，于37℃下避光染色30 min。将染色后的脑组织置于4℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，拍照，采用Image Pro Plus 7.0软件处理并计算脑梗死体积[正常脑组织染色后呈红色（非苍白区），梗死脑组织因未着色而呈白色（苍白区）；脑梗死面积为对侧正常脑组织半球面积与患侧正常脑组织面积的差值，总脑梗死体积为各脑切片梗死面积之和乘以切片厚度（2 mm），脑梗死体积百分比为总脑梗死体积与全脑体积的比值][20]。

市场价格随机的突发事件暴发后，供应商原来的最优生产量无法满足市场需求的变化.当H(x)>F(x)，即NH(q)>Q*，供应商必将增大产量以满足需求，并付出增产成本λ1；当市场需求减小，(H(x)

1 钙在氟骨症治疗中的作用

1.1 人体内高氟与低钙的关系 钙是一种化学性质较为活泼的金属元素，自然界中多以矿化物形式存在。人体中，99%的钙以羟基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］的形式储存于骨骼和牙齿，1%的钙呈离子状态分布于血液、软组织及细胞间液。钙离子在细胞外液、胞内溶质及钙库（线粒体和内质网）之间的动态流动是维持细胞代谢稳态的基础［4］，胞内钙离子也作为信号转导通路的关键信使发挥细胞调节的作用。此外，机体内许多酶具有钙依赖性，或由大量含钙成分构成，其活性受到钙离子的调节。

氟是元素周期表中电负性最强的元素，也是最活泼的非金属元素，其单质气体形式能与许多元素发生爆炸反应，甚至能与部分惰性气体在一定条件下形成络合物。正常成年人体内含氟约2.6 g，其中90%分布于骨骼和牙齿，骨骼和牙齿也被称为人体内的“氟库”。氟于人体而言是一把“双刃剑”，适量氟化物通过取代牙釉质与骨骼羟基磷灰石中的羟基（·OH），转化为结晶度更高的氟磷灰石［（Ca5F（PO4）3］，以此来预防龋齿和抗骨质疏松［5］。但同时，氟的预期剂量与有害剂量差距极小，当长期摄取的氟化物超过生理需要量时便会诱发对骨质及牙釉质的破坏。极强的电负性及活泼的化学性质使得氟与许多阳离子相互作用，其中金属阳离子对氟化物具有相对亲和力，这种亲和力是由三个因素驱动的：形成的负的吉布斯自由能，高稳定常数，以及金属氟化物形成后的低溶解度［6］。钙作为人体内含量最多的金属元素，与氟一样是骨骼和牙齿的重要组成成分。氟是一种趋骨性元素，过量氟化物摄入后沉积于骨骼，通过干扰钙离子的正常代谢并抑制相关酶活性，介导氟骨症的发生［4］。

检测分析发现，应用两种不同稻壳所产原酒的乙酸乙酯、乳酸乙酯、总酸、总酯含量均有所差异，使用清洁稻壳，原酒中微量成分含量均有所提高，其中乙酸乙酯提高8.53%，乳酸乙酯提高7.29%，总酸提高6.76%，总酯提高8.96%，见图3。

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高氟可导致骨组织低钙，低钙诱发加剧骨组织高氟，二者对骨的作用具有一致性，互为因果，相互促进，对骨的破坏呈现扩大化效应。这从理论上初步揭示了充足的钙营养对于氟骨症预防及治疗的必要性。

因此钙营养条件决定了氟骨症骨骼状态的分型，钙对氟骨症治疗的有效性可能受到钙离子量及氟骨症类型的制约。有人建议钙剂的补充应针对骨质疏松、骨软化型氟骨症［14］，长期应用钙剂可使骨硬化和软组织钙化加重，对硬化型氟骨症的治疗可能是不利的。

钙在氟骨症的治疗及预防中的受钙补充量及氟骨症类型的制约。在膳食营养充足的氟病区，钙更多作为辅剂取得一定效果。对于膳食中钙摄入量不足、骨软化及骨质疏松型氟骨症患者，钙的补充更为关键。其次也应认识到单纯的钙营养于人而言抗氟作用有限，全面的膳食营养以及健康的饮食模式可能作为不良反应最小、最为经济及便利的方法发挥抗氟作用。

1.2 钙在氟骨症治疗中的应用 近年来相关流行病学调查发现氟骨症的严重性往往与膳食营养不良密切相关，恢复钙的摄入水平后可有效缓解氟骨症对于机体的损害。 一项地方性氟骨症最新流行病学调查［10］发现，处于氟化区的印度纳尔贡达区学龄儿童血清中的钙元素显著降低，即血清高氟往往伴随低钙。因此对氟骨症患者而言，保障膳食营养中钙的摄入尤为重要。MULUALEM 等［11］采用含钙蛋壳粉对埃塞俄比亚裂谷的妇女进行营养补充后，发现这些妇女尿氟排泄量显著减少，许多氟中毒症状得到改善。氟中毒在社会经济底层青少年中更为常见，相对充足的钙摄入量和血清25羟维生素D3（25-OH-VD）浓度可能会提高饮食钙吸收的效率，从而防止严重的氟中毒［12］。我国相关研究［13-14］发现，钙剂加维生素D治疗氟骨症效果较好。钙剂的应用在氟骨症的实际临床治疗中发挥着不可替代的作用。

过量氟化物的摄入可引起细胞外液钙离子水平下降。这种现象由三个因素所决定：①过量氟化物进入血液后与钙离子结合，导致血清钙离子暂时减少；②氟化物激活成骨细胞，加速骨转换，从而增加对钙离子的需求；③骨骼中的羟基磷灰石在氟化物作用下转化为氟磷灰石，引起骨溶解度降低，骨钙释放减少，导致细胞外液钙离子浓度降低［7］。即单独的高氟因素便可促发低钙，当同时合并钙摄入不足时，机体缺钙可能更为严重。相反，当机体缺钙时，减少了与肠道内氟化物的结合，经肠道吸收的氟化物显著增多，进而加剧了对机体的损害［8］。此外，李广生等［9］研究发现，高氟和低钙对骨的作用是同向或一致的，都可引起甲状旁腺素（PTH）分泌增加，激活成骨、破骨功能，加速骨转换。

氟骨症依据骨骼状态的不同可分为骨硬化、骨软化和骨质疏松。处于钙营养充足地区的氟骨症患者往往表现为骨质外周硬化和骨质疏松（无骨软化），而钙营养不良地区的氟骨症患者表现为骨质疏松和骨软化，氟骨症骨骼状态与钙营养条件密切关联。成骨细胞增生活跃，骨转化加速是氟骨症发病机理的中心环节，这一过程增加了对钙的需求，表现出一定的骨软化趋势。当钙营养条件充足时，满足了成骨活动对钙的需求，新骨形成增加，骨骼状态趋向于骨硬化；相反，当钙营养条件不足时，成骨活动缺乏骨钙的供应导致骨矿化受阻，骨样组织大量堆积，病变导向骨软化；另一方面，低血钙引起甲状旁腺功能亢进，甲状旁腺素（PTH）分泌增加，导致破骨细胞增生，骨吸收增强，病变导向骨质疏松。

2 钙在氟骨症治疗中的作用机制

既往研究［3］发现，成骨活性增强、骨周转加速是氟骨症发病的核心环节，但钙的补充对这一核心环节及其下游机制的具体影响尚未阐明，对这一过程的进一步研究可能是未来揭示钙治疗氟骨症机理的关键。

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2.1 钙缓解氟化物引起的骨质损害 骨骼是氟化物侵害的主要靶器官。SHANKAR 等［15］采用正常钙饮食及无氟水喂养氟中毒小鼠，有效纠正了氟对骨骼的不利影响。BHOWMIK 等［16］在补钙的基础上，配合维生素D 的使用减少了氟在小鼠骨骼的沉积，并维持了骨骼的元素稳态。进一步研究发现，钙对骨骼的保护作用可能与对骨代谢信号通路的调节有关。骨代谢紊乱是氟骨症的重要病理特征，骨细胞中代谢通路的异常加剧了氟骨症的发生及发展。相关研究表明，补钙可通过对PI3K/AKT［17］、局灶性粘附及一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）［18］等多条骨代谢信号通路的调节缓解氟化物引起的骨损伤。此外，内质网应激和线粒体损伤也作为慢性氟中毒发病机制中的重要一环介导了其发生及发展。当过量氟化物摄入时，可引起内质网蛋白错误折叠、积累及线粒体结构、功能破坏进而促发细胞的程序性凋亡。而WANG 等［19］研究证实，抑制内质网应激和线粒体功能也是钙减轻骨损伤的常见信号途径。因此，钙的补充通过抑制多条骨代谢通路及两种细胞器损伤效应减轻了氟对骨质的破坏。

近年来钙在分子层面对氟的拮抗作用已然成为氟骨症领域的热点研究方向之一，其致病机理除了涉及骨骼、牙齿等骨相组织的参与，慢性氟中毒导致的肝、肾及神经系统等非骨相损害也作为氟骨症的常见并发症与这一致病机理密切联系。外源性摄入钙可显著逆转高氟诱导的人体骨代谢通路异常、钙稳态失衡、氧化应激、线粒体损伤、内质网应激及三种凋亡路径等多种致病机制，减轻氟对人体多种骨相及非骨相器官的损害。

2.2 钙减轻氟化物对牙骨质的损害 过量氟化物可诱导牙成釉细胞的内质网应激［20］。而蛋白激酶R样内质网激酶/真核启动因子2a/活化转录因子4/CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白（PERK/eIF2a/ATF4/CHOP）轴是一种重要的内质网应激信号通路，在细胞凋亡和肿瘤进展中发挥着关键作用［21］。最新研究［22］发现，在补充钙离子后，染氟小鼠牙成釉细胞内的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 通路效应显著缓解，减少了氟的细胞毒性作用。由此看来，钙能减轻氟化物对牙骨质的损害，其主要机理涉及钙对内质网应激中PERK 通路的拮抗。此外，内质网应激还包含了肌醇需求酶1（IRE1）和活化转录因子4（ATF4）通路，这两条通路同样参与了氟诱导的内质网应激［23］，但对于二者在钙拮抗氟牙毒性中的作用还有待进一步研究。

2.3 钙减轻氟化物造成的肝肾损伤 肝肾是非骨相器官中氟的重要攻击靶点。细胞凋亡是一种系统调节的程序性死亡，作为氟中毒致病机理的终末环节，包含了外在的死亡受体通路、内在的线粒体通路及内质网通路三条凋亡路径。补钙可通过抑制凋亡相关因子/凋亡相关因子配体（FAS/FASL）、肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子（TNFR/TNF）、死亡受体-5/肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（DR5/TRAIL）等死亡受体通路缓解氟诱导的大鼠肾细胞凋亡［24］，也可通过增加抗凋亡基因Bcl-2 的表达，抑制线粒体凋亡途径减轻氟化钠（NaF）引起的大鼠肝细胞损伤［25］。此外，氧化应激作为慢性氟中毒受众最广的机制之一，是一种由氟引起的体内氧化与抗氧化系统失衡、活性氧（ROS）过度生成，进而促发细胞损伤的级联反应。在一项对大鼠肾细胞的研究［26］中发现充足的钙营养可拮抗氟化物引起的氧化应激及进一步诱发的下游线粒体损伤，并通过线粒体通路介导凋亡的发生。总之，钙可通过抑制死亡受体相关通路的表达、增加肝肾细胞抗凋亡基因表达、拮抗氧化应激及线粒体损伤进而抑制线粒体凋亡途径减轻氟化物诱导的肝肾毒性。而对于氧化应激、线粒体损伤及线粒体凋亡等机制之间的发生顺序、相互作用关系还有待进一步研究阐明。

2.4 钙缓解氟化物引起的神经损害 氟化物的神经毒性是目前研究的热点。研究［27］表明，氟化物诱导大鼠后代脑细胞凋亡的分子机制可能包括抗凋亡分子Bcl-2 mRNA 表达水平的下降和凋亡相关分子半胱氨酸蛋白酶12（caspase 12）mRNA 表达水平的增加；内质网应激途径也与海马损伤密切相关［28］；高氟还可引起海马突触结构的改变，体现在突触密度、突触活动区长度、厚度等结构参数的下降，进而导致大鼠学习和记忆力受损［29］。在这些研究中都有一个共同特点：高膳食钙通过逆转Bcl-2 mRNA 及caspase 12 mRNA 的表达趋势，抑制内质网应激途径的激活，显著扭转海马突触结构参数的异常改变，有效缓解了氟化物对大鼠海马结构和功能的破坏；相反，低膳食钙通过促进上述改变，进一步加剧了氟化物对脑细胞的毒性作用［27-29］。因此，钙对氟化物神经毒性的保护作用不仅涉及对凋亡相关分子的调控，还与钙剂对大脑相关结构及功能病理改变的抑制甚至逆转相关，且在宏观层面上表现为大脑学习及记忆力的改善。

另外，钙对氟化物神经毒性的拮抗作用还涉及对细胞内钙稳态的调节。钙稳态是指在细胞膜和细胞器各种钙离子通透和转运机制的参与下，胞内游离钙离子浓度保持相对较低且平衡的状态。氟可对上述钙离子通道造成干扰，导致细胞内钙超载进而促发细胞凋亡。邵丹丹等人［30］的研究发现采用低钙饲养染氟海马细胞后，相关钙通道蛋白基因表达水平发生改变、细胞凋亡率显著增加。反之，高钙膳食通过逆转钙通道蛋白基因的表达，减少了海马细胞的凋亡。近年来，神经退行性疾病、急性脑缺血等神经系统疾病的研究［31］发现，对钙稳态的维持和恢复可能是预防和治疗疾病的新途径。而以上研究阐明了对于特定氟暴露情况下所诱导的神经系统损伤，钙的补充能够显著逆转细胞膜或内质网膜钙离子转运相关分子表达的异常，抑制细胞内钙超载，维持钙稳态，这一研究进一步证实了神经系统疾病治疗中对钙稳态的恢复具有重要意义。另外，对氟化物神经系统损伤中钙相关靶点的挖掘及钙稳态的恢复应作为今后研究的重点进行展开。

综上所述，外源性摄入钙可通过逆转高氟诱导的骨代谢通路异常、钙稳态失衡、氧化应激、内质网应激、线粒体损伤及三种凋亡路径等多项致病机理，减轻氟对机体多种骨相及非骨相器官的损害。尽管当前关于钙剂的实际临床应用取得了一定成就，但其疗效也在一定程度受到钙补充量及氟骨症类型的制约。而在脱氟的基础之上，全面的膳食营养以及健康的饮食模式可能作为一种更为有效和全面的方式发挥抗氟作用。