姜中姜辣素和黄酮的提取及抗氧化性研究*

卢 敏，黄 艳，陈艳艳，王福梅

(河南城建学院生命科学与工程学院，河南 平顶山 467000)

姜主要种植在我国中部、东南和西南部，是药中佳品，主要用于治疗风寒感冒、呕吐、痰饮等，具有抗菌消炎、抗氧化、降血糖血脂[1-2]等功能。姜中含有糖类、蛋白质、脂类、维生素和多种微量元素等营养物质[3-4]，还含有许多药理活性物质，如姜辣素、黄酮、挥发油、多糖等[5]。姜辣素具有多重生理功效，其中抗氧化能力最强[6]。黄酮是一种天然抗氧化剂，可以清除人身体里面游离的氧自由基，减缓细胞的衰亡。黄酮及姜辣素是生姜具有抗氧化活性的主要原因[7-8]。生姜对多种肿瘤细胞的活性均有较好抑制作用[9]。生姜中的6-姜烯酚可以有效地保护脑缺血后的大脑[10]，此外，生姜对于脂肪肝也具有保护作用[11]。在2020年的新型冠状病毒疫情期间，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中将生姜等中药材用于治疗新型冠状病毒肺炎。生姜具有特殊风味、药效温和无毒，可长期食用且无副作用[12]，目前，其常用于调料品。该研究以干姜为原料，分析不同提取方法对姜辣素和黄酮含量的影响，以及其抗氧化活性，旨在为生姜的加工利用提供依据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

干姜，罗平东恒姜业有限公司。姜经干燥、粉碎后过60目筛，10 g每份分装保存备用。分装好的姜粉加60 mL石油醚，静置6 h后脱脂，离心后烘干备用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、芦丁标准品，北京索莱宝科技有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，上海麦克林生化科技有限公司；VC抗坏血酸，天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2 实验仪器

GENESYS 10S紫外分光光度计，美国赛默飞世尔科技公司；QΜINTIX型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；PE Eenspire型酶标仪，美国PE公司；2XZ-2型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司等。

1.3 实验方法

(1)姜辣素的提取

超声波法：取一份脱脂姜粉，加60%的乙醇溶液150 mL，超声功率600 W，10 min，离心取上清，旋转蒸发浓缩。纤维素酶法：取一份脱脂姜粉，加400 mL蒸馏水、0.14 g纤维素酶，65 ℃放置85 min，加无水乙醇后55 ℃沉淀25 min，离心取上清液，旋转蒸发浓缩。将上述浓缩液加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃沉淀10 h，5000 r/min冷冻离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得固体粗品。

(2)黄酮的提取

微波辅助法：取一份脱脂姜粉，加75%的乙醇溶液200 mL，微波功率600 W，25 s，置于室温浸提4 h，取上清液，旋转蒸发浓缩。超声波法：取一份脱脂姜粉，加90%的乙醇溶液150 mL，超声功率600 W，40 min，取上清液，旋转蒸发浓缩。将上述浓缩液加3倍体积的无水乙醇，4 ℃沉淀10 h，5000 r/min冷冻离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得固体粗品。

1.4 姜辣素和黄酮含量测定

1.4.1 姜辣素的含量测定

绘制标准曲线：准确量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的香草醛标准溶液，不足1.0 mL的加75%乙醇补足，各管中加入浓度为8%的Na2CO3溶液1.5 mL，室温放置3～5 min，随后加入80%的Folin酚试剂0.75 mL，摇匀，32.5 ℃下反应2.25 h，在280 nm下测定吸光度值。以香草醛浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，确定回归方程[13]。

姜辣素样品含量测定：分别取超声提取和酶提取的提取液各1 mL，按照上述测定方法测量吸光度，带入回归方程，求得姜辣素样品浓度。进一步由计算公式(1)求得姜辣素含量，计算公式2求得姜辣素纯度。

(1)

式中:2.003为香草醛换算姜辣素的系数；Y为与标准曲线对应的浓度，mg/mL；V0为样品提取液体积，mL；W为样品重量，g。

(2)

式中:C为根据标准方程计算出的样品含量，mg/g；M为样品的质量，g；m为粗提物质量，mg。

1.4.2 黄酮的含量测定

绘制芦丁标准曲线：准确量取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准品溶液，分别加入10 mL容量瓶中，不足5 mL加60%的乙醇补足，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入4%的NaOH溶液4 mL，混匀，60%的乙醇溶液定容至10 mL摇匀，静置15 min，在510 nm波长下测吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，绘制标准曲线确定回归方程。

黄酮样品含量测定：分别取微波提取和超声提取的提取液1 mL，按照上述测定方法测量吸光度。带入回归方程，求得黄酮样品浓度。进而按照公式(3)求得黄酮含量，按照公式(2)求得黄酮纯度。

(3)

式中：C为黄酮的质量浓度，mg/mL；V为样品提取液体积，mL；T为稀释倍数；m为粗提物质量，g。

1.5 姜辣素和黄酮提取物抗氧化活性测定

1.5.1 DPPH抗氧化实验

以VC作为阳性对照物，姜辣素和黄酮的样品溶液浓度调整为1 mg/mL，设置6个浓度梯度，样品溶液和DPPH溶液混匀之后避光0.5 h，517 nm处测吸光度值。以水和DPPH溶液作为空白组，无水乙醇代替DPPH溶液作为对照组。清除率计算公式(4)如下：

(4)

式中：Ai为样品和DPPH的吸光值；Aj为样品和无水乙醇的吸光值；AC为水和DPPH的吸光值。

DPPH的半数清除率(IC50)，指清除50%的自由基，所需要的样品最终浓度。以实验所得的抗氧化物浓度为横坐标，清除率为纵坐标，计算线性回归方程，将清除率50%带入方程中，求得对应的横坐标即为DPPH的IC50。

1.5.2 ABTS抗氧化实验

以VC作为阳性对照物，姜辣素和黄酮溶液的浓度配置成1 mg/mL，设置6个浓度梯度，样品溶液和ABTS溶液混匀之后避光0.5 h，734 nm处测得吸光值。同样方法测得样品和蒸馏水组，无水乙醇和ABTS组的吸光度值。清除率计算公式(5)如下：

(5)

式中：Ai为样品和ABTS的吸光值；Aj为样品和蒸馏水的吸光值；Ac无水乙醇和ABTS的吸光值。

ABTS的半数清除率计算同DPPH计算方法。

1.5.3 FRAP抗氧化实验

设置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的6个浓度梯度的FeSO4标准液0.3 mL，加入3 mL FRAP工作液和0.3 mL超纯水。混匀后反应5 min，593 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线。

姜辣素和黄酮溶液的浓度配成1 mg/mL，量取0.1 mL的样品溶液，按照上述测定方法测定吸光度，带入标准曲线计算。

2 结果与分析

2.1 含量的测定

2.1.1 姜辣素的含量测定

实验采用福林酚法绘制姜辣素含量测定的标准曲线，回归方程为：Y=0.003X+0.0159(R2=0.9963)，在0～320 μg/mL范围内香草醛溶液浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

由表1可知，超声提取姜辣素的含量为2.1 mg/g、纤维素酶提姜辣素含量为1.8 mg/g，超声法提取的姜辣素纯度相对高于纤维素酶法。

表1 姜辣素提取液的含量和纯度

2.1.2 黄酮的含量测定

基于芦丁标准溶液法绘制黄酮含量测定的标准曲线，回归方程为：Y=5.884X+0.0082(R2=0.9985)，在0.02～0.20 mg/mL范围内芦丁溶液浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

由表2可知，微波提取黄酮的含量为1.14 mg/g、超声提取黄酮含量0.936 mg/g，微波辅助法提取黄酮纯度稍高。

表2 黄酮的含量和纯度

2.2 抗氧化活性

2.2.1 姜辣素和黄酮对DPPH的清除率

由图1可知，采用不同的方法来提取姜辣素和黄酮，提取物抗氧化性是有一定差异的，但整体而言，姜辣素和黄酮在一定浓度范围内对DPPH自由基的清除率都随着浓度的增加而增大。

图1 姜辣素和黄酮DPPH清除率

超声姜辣素抗氧化性强于酶提姜辣素。超声提取和酶提取姜辣素的IC50值分别为0.187 mg/mL、0.201 mg/mL，与刘步云等[8]对不同品种的姜提取物的DPPH抗氧化性(0.79～4.35 mg/mL)相比，该实验条件下获取的姜辣素DPPH抗氧化性相对较强。

微波黄酮的抗氧化性强于超声黄酮。微波提取和超声提取黄酮的IC50值分别为0.185 mg/mL、0.197 mg/mL，与孙昕等[14]对姜提取的DPPH抗氧化性(0.35 mg/mL)相比，该实验条件下获取的黄酮DPPH抗氧化性相对较强。

2.2.2 姜辣素和黄酮对ABTS的清除率

由图2可知，不同方法来提取姜辣素和黄酮，其抗氧化性有一定差别，但整体而言，姜辣素和黄酮在一定浓度范围内对ABTS自由基的清除率都随着浓度的增加而增大。

图2 姜辣素和黄酮的ABTS清除率

超声姜辣素的抗氧化性强于酶提姜辣素。超声提取和酶提姜辣素的IC50值分别为0.227 mg/mL、0.253 mg/mL，与刘步云等[8]对不同品种的姜提取物的ABTS抗氧化性(最低为0.63 mg/mL)相比，该实验条件下获取的姜辣素ABTS抗氧化性相对较强。

微波黄酮的抗氧化性强于超声黄酮。微波提取和超声提取黄酮的IC50值分别为0.215 mg/mL、0.248 mg/mL，与孙昕等[14]姜提取物的ABTS抗氧化性(0.92 mg/mL)相比，该实验条件下获取的黄酮ABTS抗氧化性相对较强。

2.2.3 FRAP抗氧化测定

基于FeSO4测定的标准曲线，其回归方程为Y=0.1603X+0.046(R2=0.9962)，表明在0～1.0 mM范围内FeSO4溶液浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

姜辣素和黄酮的FRAP抗氧化测定结果见表3，由表3可知，不同的方法提取的姜辣素其抗氧化性有一定差异。超声提取姜辣素的抗氧化活性强于酶提姜辣素，微波提取黄酮的抗氧化活性强于超声提取黄酮。

表3 姜辣素和黄酮的FRAP抗氧化活性

3 结 论

本文通过不同的方法对姜中活性成分的提取进行探索，同时测定姜辣素和黄酮物质的抗氧化能力，以期为姜的深加工利用提供一定的研究基础。测定结果显示不同的方法处理对姜辣素、黄酮的提取率有一定的影响。后续可优先选用超声法提取姜辣素，微波辅助法提取黄酮，并对该两种方法进行实验条件的优化，进一步增加提取率。抗氧化活性测定结果显示，姜辣素和黄酮的DPPH、ABTS以及FRAP抗氧化性最强的为微波提取黄酮，其次为超声提取姜辣素。从三种抗氧化活性测定结果来看，姜辣素和黄酮都具有一定的抗氧化性，但黄酮的抗氧化性强于姜辣素，且微波辅助提取黄酮和超声提取姜辣素的抗氧化活性最强。

综上所述，通过超声提取姜辣素和微波辅助提取黄酮的方法提取率相对较高，且所得产品纯度相对较高，抗氧化活性相对较强，后续可通过该两种提取方法对姜辣素和黄酮物质的提取做进一步研究。