肉苁蓉多糖对肺癌细胞A549生物学行为的影响

樊黎丽， 孟 泳， 赵润杨， 王艳梅， 唐引引

[河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)，河南 郑州 450000]

肺癌是我国发病率和致死率第一位的恶性肿瘤，肺癌的治疗手段有免疫、手术及化疗等[1]。研究表明，传统中药及其成分在肺癌的治疗中具有较大优势，可提高肺癌疗效[2-3]。肉苁蓉是我国名贵药材，其主要成分包括苯乙醇总苷、多糖、环烯醚萜类、生物碱和木脂素类等。研究发现，肉苁蓉苯乙醇总苷能降低肝癌H22荷瘤小鼠肝脏损伤，并对其肿瘤生长有抑制作用[4]。肉苁蓉活性成分麦角甾苷能够抑制裸鼠移植瘤模型肿瘤生长及大肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[5]。肉苁蓉多糖可能通过增加自然杀伤细胞和白细胞介素2(IL-2)的活性抑制Lewis肺癌和S180肉瘤细胞[6]。然而，肉苁蓉多糖在肺癌中的潜在功能、生物发生过程和潜在机制仍不清楚。研究表明，lncRNA在肺癌中常失调表达，并且在肺癌的发生、发展和治疗中具有重要作用[7]。LINC01410在宫内膜癌中高表达，影响子宫内膜癌患者的预后[8]；LINC01410过表达通过抑制miR-532-5p促进胃癌血管生成和转移[9]；抑制LINC01410表达可抑制胆管癌细胞和乳头状甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[10-11]，而LINC01410在肺癌中的作用尚不明确。本实验旨在研究肉苁蓉多糖及LINC01410对肺癌细胞恶性表型的影响，以及LINC01410是否参与肉苁蓉多糖对肺癌细胞恶性生物学行为的调控，以期为肉苁蓉多糖的深入研究提供依据。

1 材料

肺癌细胞A549购自美国菌种保藏中心(ATCC)。肉苁蓉多糖(纯度≥98%，货号D3281)购自上海宝曼生物科技有限公司。胎牛血清购自广州硕恒生物科技有限公司；RPMI-1640培养基购自杭州仟诺生物科技有限公司；MTT试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel购自北京优尼康生物科技有限公司；凋亡试剂盒购自德国PromoCell公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自上海善然生物科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养与分组 A549细胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。分别用质量浓度为100、200、400 ng/mL的肉苁蓉多糖处理对数生长期细胞，记为肉苁蓉多糖100、200、400 ng/mL组；未用肉苁蓉多糖处理的A549细胞为对照组。A549细胞分别转染si-NC或si-LINC0141，记为si-NC组、si-LINC01410组；si-NC、si-LINC01410转染至A549细胞后用400 ng/mL肉苁蓉多糖处理，记为肉苁蓉多糖400 ng/mL+pcDNA组、肉苁蓉多糖400 ng/mL+pcDNA-LINC01410组。

2.2 MTT法检测A549细胞增殖率 将A549细胞分别用质量浓度为50、100、150、200、250、300、350、400 ng/mL的肉苁蓉多糖处理。收集各组A549细胞置于96孔板，每孔加入MTT 20 μL，在培养箱内继续培养4 h后，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，于490 nm波长处检测各组细胞光密度(OD)值，计算细胞增殖率。

2.3 克隆形成实验检测A549细胞克隆能力 收集各组A549细胞，调整密度为1×105/mL，每孔100 μL接种于6孔板，置于培养箱内培养直至出现肉眼可见的细胞克隆团，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，1%结晶紫溶液染色15 min，光学显微镜下观察，记录菌落数(>50个细胞)。

2.4 流式细胞术检测A549细胞凋亡率 收集各组A549细胞重悬于100 μL磷酸盐缓冲盐水缓冲液(1×106/mL)，试管中加入1 mL细胞悬液和10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育30 min，收集细胞，通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

2.5 Transwell法检测A549细胞迁移及侵袭能力 将各组A549细胞悬液(2×104/200 μL，无血清培养基)均匀铺于Transwell小室上室，将含有10% FBS的500 μL RPMI-1640培养基加入小室下室，37 ℃培养24 h，擦除上室残留细胞，下室细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，在光学显微镜下观察细胞，随机选择5个视野计数。细胞侵袭实验，将Matrigel预涂在Transwell小室上室，其余步骤同迁移实验。

2.6 RT-qPCR法检测A549细胞中LINC01410 mRNA表达 采用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书操作合成cDNA。反应体系为2 μL反转录产物、10 μL SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 μL、7 μL无菌水。反应条件为95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算LINC01410 mRNA相对表达。引物序列为LINC01410正向5′-GT GACAAGAATGGCCCAAGC-3′，反向5′-ACTGTGCACC TGTTACACCA-3′；内参GAPDH正向5′-TGTTGCCATC AATCACCCCTT-3′，反向5′-CTCCACGACGTACTC AGCG-3′。

3 结果

3.1 肉苁蓉多糖对A549细胞增殖、凋亡的影响 与对照组比较，肉苁蓉多糖各剂量组A549细胞增殖率升高(P<0.05)，IC50为319.8 ng/mL，见表1。与对照组比较，肉苁蓉多糖100、200、400 ng/mL组A549细胞增殖率降低(P<0.05)，克隆形成数减少(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见图1、表2。

表2 肉苁蓉多糖对A549细胞增殖率、克隆形成及凋亡率的影响

表1 肉苁蓉多糖对A549细胞增殖率的影响

3.2 肉苁蓉多糖对A549细胞迁移及侵袭能力的影响 与对照组比较，肉苁蓉多糖各剂量组A549细胞迁移和侵袭数均减少(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见图2、表3。

表3 肉苁蓉多糖对A549细胞迁移及侵袭能力的影响

3.3 肉苁蓉多糖对A549细胞中LINC01410 mRNA表达的影响 与对照组比较，肉苁蓉多糖各剂量组A549细胞中LINC01410 mRNA表达均降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见表4。

表4 肉苁蓉多糖对A549细胞中LINC01410 mRNA表达的影响

3.4 抑制LINC01410表达对A549细胞增殖凋亡的影响 与si-NC组比较，si-LINC01410组A549细胞增殖率降低(P<0.05)，克隆形成数减少(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，见图3、表5。

表5 抑制LINC01410表达对A549细胞增殖率、克隆形成及凋亡率的影响

3.5 抑制LINC01410表达对A549细胞迁移及侵袭能力的影响 与si-NC组比较，si-LINC01410组A549细胞迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05)，见图4、表6。

表6 抑制LINC01410表达对A549细胞迁移及侵袭能力的影响

3.6 过表达LINC01410与肉苁蓉多糖对A549细胞增殖、凋亡的影响 与肉苁蓉多糖400 ng/mL+pcDNA组比较，肉苁蓉多糖400 ng/mL+pcDNA-LINC01410组A549细胞增殖率升高(P<0.05)，克隆形成数增加(P<0.05)，细胞凋亡率降低(P<0.05)，见图5、表7。

表7 过表达LINC01410与肉苁蓉多糖对A549细胞增殖率、克隆形成及凋亡的影响

3.7 过表达LINC01410与肉苁蓉多糖对A549细胞迁移及侵袭能力的影响 与肉苁蓉多糖400 ng/mL+pcDNA组比较，肉苁蓉多糖400 ng/mL+pcDNA-LINC01410组A549细胞迁移及侵袭细胞数增加(P<0.05)，见图6、表8。

表8 过表达LINC01410与肉苁蓉多糖对A549细胞迁移及侵袭能力的影响

4 讨论

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，提高患者生存期和生活质量已成为肺癌临床研究重点。中医药在治疗中晚期肺癌上取得一定的成果[12]。研究发现，植物多糖具有抗肿瘤、免疫调节等活性，且对人体毒副作用较小，是潜在的新型抗肿瘤药物资源[13]。玉竹多糖可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路表达，抑制细胞周期蛋白表达，从而阻止肺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡[14]；苦参多糖能够抑制肺癌细胞增殖、侵袭、迁移，促进肺癌细胞凋亡[15]；苦荞茶多糖能够促进活性氧生成、降低线粒体膜电位，进而抑制肺癌细胞A549增殖，促进细胞凋亡[16]。肉苁蓉多糖是肉苁蓉的主要活性成分，可用于肠道炎症性增生和乙醇引起的肝损伤，具有免疫调节、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等作用，可以用作抗炎、抗疲劳、和抗肿瘤试剂[17-18]。然而，肉苁蓉多糖在肺癌中的作用尚不清楚。本实验研究发现，肉苁蓉多糖可以抑制肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，且呈剂量依赖性，表明肉苁蓉多糖可能通过抑制癌细胞增殖和转移来阻碍肺癌的发展。

lncRNAs是长度大于200个核苷酸的非编码 RNA，虽然lncRNAs不能被翻译成蛋白质，但其参与多种生理活动，包括染色体修饰、转录激活和干扰以及细胞的生长、转移和凋亡[19-20]。研究表明，lncRNAs在癌症中差异表达，且异常表达的lncRNAs与癌症发生发展有关[21-23]。重要的是，lncRNAs与肺癌发展密切相关，参与癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程[24-25]。研究发现，LINC01410在结肠癌组织中高表达，与患者预后不良有关；LINC01410表达降低可以抑制HT-29、SW620细胞的增殖和侵袭能力，并抑制细胞周期[26]。LINC01410表达在宫颈癌组织和细胞系中的升高与不良预后相关；LINC01410沉默可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[27]。胰腺癌组织和细胞中LINC01410表达升高，降低癌细胞中LINC01410表达可破坏细胞的迁移和生长[28]。本实验发现，降低LINC01410表达可以抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。此外，本实验还发现，肉苁蓉多糖处理的肺癌细胞A549中LINC01410表达降低；而过表达LINC01410可逆转肉苁蓉肉多糖对A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。

综上所述，肉苁蓉多糖可能通过下调LINC01410表达抑制肺癌细胞增殖、克隆形成及迁移侵袭，并促进细胞凋亡。