小檗碱通过PERK-ATF4通路对高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的改善作用

段书众， 于文会， 张 华， 王景福*

(1.承德医学院附属医院肾脏内科，河北 承德 067000；2.承德医学院附属医院药学部，河北 承德 067000)

糖尿病是临床常见的代谢障碍疾病，近年来发病人数不断增长，已成为严重威胁人类健康的全球性疾病[1]。血管并发症是糖尿病患者常见的一类并发症，发病率高、危险性大[2]，而血管钙化是糖尿病发生血管并发症的主要特征，是增加糖尿病患者心血管疾病发病率、死亡率的重要推手[3]。因此，探索糖尿病血管钙化的潜在作用机制，并采取有效防治措施具有重要意义。目前研究认为，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)由收缩表型转化为成骨表型是血管钙化形成的共同基础[4]。蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)-激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的经典信号通路，通过PERK发生自身磷酸化，进而诱导ATF4表达发挥作用[5]。研究发现，ERS可能介导高糖引起VSMC钙化的过程[6]。

小檗碱是广泛存在于黄柏、黄连等传统中草药中的植物碱，具有降脂、降糖、抗炎、抗氧化等作用[7]。目前研究表明，小檗碱能缓解ERS，且其对代谢综合征器官损害的保护作用可能与改善ERS有关[8]。另有研究发现，小檗碱对血小板源生长因子诱导的VSMC钙化具有抑制作用[9]。本研究将基于PERK-ATF4通路，探讨小檗碱对高糖诱导的VSMC钙化的减轻作用。

1 材料

1.1 细胞 大鼠胸主动脉平滑肌细胞VSMC(货号FE563)购自美国ATCC库，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞长满后，传代3次用于后续实验。

1.2 试剂与药物 小檗碱对照品(纯度≥97%，货号B832574)购自北京泰泽嘉业科技发展有限公司。DMEM培养基(货号90113)购自北京索莱宝科技有限公司；pcDNA、pcDNA-ATF4由上海易汇生物科技有限公司构建；钙离子比色法检测试剂盒(货号XG-E98821)购自上海西格生物科技有限公司；BCA蛋白检测试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒(货号ALH371-QIP、GL2018-RDH)购自北京百奥莱博科技有限公司；p-PERK抗体、PERK抗体(货号3192、3179)购自美国Cell Signaling Technology公司；ATF4抗体、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)抗体、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2)抗体、Osterix抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(货号ab23760、ab75285、ab23981、ab209484、ab245356、ab7090)购自英国Abcam公司。

1.3 仪器 NAPCO-8800型恒温培养箱购自美国Shellab公司；Stat Fax-2100型酶标仪购自美国Awareness公司；AlphaImager Mini型凝胶成像系统购自美国ProteinSimple公司。

2 方法

2.1 细胞分组及给药 取对数生长期VSMC细胞，以每孔4.0×104个的密度接种于24孔板，分为对照组，高糖组，小檗碱低、中、高剂量组，小檗碱+pcDNA组，小檗碱+pcDNA-ATF4组。高糖组培养基中加35 mmol/L葡萄糖；小檗碱低、中、高剂量组加35 mmol/L葡萄糖和浓度分别为50、100、200 μmol/L的小檗碱；小檗碱+pcDNA组、小檗碱+pcDNA-ATF4组加35 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L小檗碱，同时VSMC细胞分别转染pcDNA、pcDNA-ATF4。小檗碱高剂量组、小檗碱+pcDNA组、小檗碱+pcDNA-ATF4组VSMC细胞培养48 h，RT-qPCR法检测细胞中ATF4 mRNA表达情况，以验证转染效率，内参基因为β-actin，结果通过2-ΔΔCT法计算表示。

2.2 甲基百里香酚蓝比色法检测钙水平 各组VSMC细胞培养7 d，用PBS冲洗3次，每孔加入1 mL 0.6 mol/L HCl，于37 ℃环境中脱钙1 h，离心分离上清液，采用钙离子比色法检测试剂盒检测上清液中钙浓度；剩余细胞用细胞裂解液裂解30 min，BCA法测定细胞蛋白浓度，将上清液中钙浓度用细胞蛋白浓度加以校正，即上清液中钙浓度/细胞蛋白浓度表示钙相对水平。

2.3 磷酸苯二钠法检测ALP活性 各组VSMC细胞培养7 d，用PBS冲洗3次，每孔加入l mL含1% TritonX的生理盐水，于4 ℃环境中放置24 h，超声裂解细胞30 s，离心分离上清液，采用ALP检测试剂盒检测ALP活性；剩余细胞用细胞裂解液裂解30 min，BCA法测定细胞蛋白浓度，将上清液ALP活性用细胞蛋白浓度加以校正，即上清液中ALP活性/细胞蛋白浓度表示ALP活性。

2.4 Western blot法检测细胞中PERK-ATF4通路及骨相关蛋白表达 各组VSMC细胞培养7 d，离心收集细胞，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定细胞蛋白表达，电泳分离目标蛋白，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，将膜放入相应蛋白抗体稀释液(p-PERK抗体、PERK抗体、ATF4抗体、OPN抗体、Runx2抗体、Osterix抗体、GAPDH抗体，均1∶1 500稀释)中4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，将膜放入用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗稀释液(1∶3 000)中室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL法显色，曝光，凝胶成像系统扫描图像，将目的蛋白条带灰度值用内参蛋白GAPDH条带灰度值加以校正，即目的蛋白条带灰度值/内参蛋白GAPDH条带灰度值表示目的蛋白相对表达。

3 结果

3.1 转染效率验证 小檗碱高剂量组与小檗碱+pcDNA组VSMC细胞中ATF4 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；与小檗碱+pcDNA组比较，小檗碱+pcDNA-ATF4组VSMC细胞中ATF4 mRNA表达升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组VSMC细胞中ATF4 mRNA表达比较

3.2 小檗碱对VSMC细胞钙水平的影响 与对照组比较，高糖组VSMC细胞钙水平升高(P<0.05)；与高糖组比较，小檗碱各剂量组VSMC细胞钙水平降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性；小檗碱高剂量组与小檗碱+pcDNA组VSMC细胞钙水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与小檗碱+pcDNA组比较，小檗碱+pcDNA-ATF4组VSMC细胞钙水平升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组VSMC细胞钙水平比较

3.3 小檗碱对VSMC细胞ALP活性的影响 与对照组比较，高糖组VSMC细胞ALP活性升高(P<0.05)；与高糖组比较，小檗碱各剂量组VSMC细胞ALP活性降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性；小檗碱高剂量组与小檗碱+pcDNA组VSMC细胞ALP活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与小檗碱+pcDNA组比较，小檗碱+pcDNA-ATF4组VSMC细胞ALP活性升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组VSMC细胞ALP活性比较

3.4 小檗碱对VSMC细胞中PERK-ATF4通路及骨相关蛋白表达的影响 与对照组比较，高糖组VSMC细胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，小檗碱各剂量组VSMC细胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性；小檗碱高剂量组与小檗碱+pcDNA组VSMC细胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与小檗碱+pcDNA组比较，小檗碱+pcDNA-ATF4组VSMC细胞中p-PERK/PERK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达升高(P<0.05)，见图1、表4。

表4 各组VSMC细胞中p-PERK、PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达比较

4 讨论

血管钙化是引起糖尿病并发心血管疾病的危险因素，同时是升高疾病死亡率的重要原因[10]。VSMC是参与血管钙化发生的主要细胞，在受到高糖、氧化应激等刺激因素的作用后，由收缩表型向成骨样细胞表型转化，并分泌大量骨相关蛋白，从而诱导细胞钙化发生[11]。本研究采用含高糖的培养液模拟糖尿病机体内的高糖环境，发现高糖组VSMC细胞钙水平、ALP活性及细胞中成骨细胞标志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表达均升高，提示高糖能促进VSMC细胞中钙离子沉积，并诱导VSMC细胞转分化为成骨样细胞，即发生钙化。

内质网是动态膜性细胞器，含有大量伴侣蛋白、糖基化酶及氧化还原酶，具有蛋白质合成、修饰、折叠、脂质、类固醇、糖原合成及钙储存、钙稳态维持等多种功能[12]。内质网被外界环境刺激后，会发生ERS，影响许多蛋白质的合成过程[13]。曾蓉等[14]研究表明，过度的ERS会促进血管钙化的发生发展。PERK-ATF4是经典的ERS途径，在ERS发生时，PERK解除与葡萄糖调节蛋白78的结合状态，活化形成p-PERK，可通过将eIF2α磷酸化阻断合成过程，同时上调ATF4表达发挥作用[15]。沈洁等[16]研究显示，降低大鼠血糖，缓解炎性反应，可减轻ERS并抑制PERK/ATF4/CHOP信号通路激活。本研究显示，高糖组VSMC细胞中p-PERK/PERK、ATF4蛋白表达升高，提示高糖环境会诱导VSMC细胞中PERK-ATF4通路激活，发生ERS，可能与VSMC细胞钙化存在一定联系。

小檗碱是中草药提取物，在糖脂代谢、氧化应激、炎症反应等调节方面发挥重要作用[17]。张勇等[18]研究发现，小檗碱对果糖诱导的HK-2细胞内PERK通路激活过程具有抑制作用。张楠等[19]研究亦表明，小檗碱对大鼠脂肪肝缺血再灌注损伤的保护作用可能与抑制ERS有关。Li等[20]研究发现，小檗碱能调节高脂肪饮食小鼠的血脂水平，减轻炎症损伤及血管钙化，可能在改善动脉粥样硬化及心血管保护中发挥作用。本研究显示，使用不同浓度小檗碱处理高糖诱导的VSMC细胞，细胞中p-PERK/PERK、ATF4蛋白表达降低，同时钙水平、ALP活性及细胞中成骨细胞标志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表达均降低，且均呈剂量依赖性，提示小檗碱可以抑制PERK-ATF4通路激活，并减少VSMC细胞中钙离子沉积，减轻VSMC细胞钙化，但小檗碱对高糖诱导VSMC细胞钙化的减轻作用是否与抑制PERK-ATF4通路激活有关，尚缺乏验证。

为进一步探索PERK-ATF4通路在小檗碱减轻高糖诱导VSMC细胞钙化过程中发挥的作用，本研究通过向VSMC细胞转染pcDNA-ATF4上调ATF4表达，发现高糖、高浓度小檗碱处理下，上调VSMC细胞中ATF4表达后，VSMC细胞钙水平、ALP活性及细胞中成骨细胞标志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表达均升高，提示PERK-ATF4通路激活与VSMC细胞钙化有关，小檗碱可能通过抑制PERK-ATF4通路激活，对高糖诱导VSMC细胞钙化起抑制作用。

综上所述，小檗碱能减轻高糖诱导的VSMC细胞钙化，其机制可能与抑制PERK-ATF4通路激活有关。