基于PI3K/Akt/FoxO1信号通路探索白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠胰腺组织的保护作用

王 芳， 姚敏娜， 张 雅， 王四旺*

(1.陕西能源职业技术学院医学院，陕西 咸阳 712000；2.空军军医大学药学院，陕西 西安 710032)

据国际糖尿病联盟2017年报道，全球2型糖尿病患者约有4.51亿，在2045年预计达到6.93亿，预测到2035年我国2型糖尿病人数将达到1.43亿[1-2]。2型糖尿病发病机制复杂，目前认为胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能缺陷是其发病的主要机制[3]，胰岛素抵抗伴随其发生、发展；胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发生的必要条件[4]，而氧化应激可以直接或间接加重胰岛素抵抗以及胰岛β细胞的损伤[5-7]。因此，保护胰岛β细胞功能，抑制胰岛β细胞凋亡对治疗2型糖尿病有着重大意义。通过研究表明，磷脂酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/磷酸化插头转录因子1(PI3K/Akt/FoxO1)信号通路对于胰岛β细胞生长、发育、增殖、凋亡、分化和胰岛素分泌等方面具有重要作用[8]。

白虎加人参汤始见于《伤寒杂病论》，由知母、石膏、甘草、粳米、人参组成，具有养阴清热，益气生津的功效，大量研究表明，白虎加人参汤可以有效改善糖尿病患者临床症状，降低血糖，改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞、抗氧化应激作用[9-13]，在临床上已被应用于2型糖尿病治疗，并且取得了很好的疗效[14-19]，但是其作用机制尚不明确。因此，本研究通过探索白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠胰腺组织的保护作用及其作用机制，以期为白虎加人参汤临床合理应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，由空军军医大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(军)2021-001。饲养条件为温度(23±2)℃，相对湿度(50±5)%，12 h/12 h自控照明，大鼠均有专业人员负责饲养，日常自由进食和饮水，适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药物 白虎加人参汤按组方比例取知母18 g、石膏50 g、炙甘草6 g、粳米9 g、人参10 g，以8倍量蒸馏水浸泡30 min，煎煮2次，合并煎液，滤过后浓缩至生药量2 g/mL，置于4 ℃冰箱中保存备用。二甲双胍(批号20190304)为阳性药，购自中美上海施贵宝制药有限公司。

1.3 试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司，批号S0130)；高脂高糖饲料(上海普路腾生物科技有限公司，批号20210621-074)；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(瑞典Mercodia公司，批号10-1250-10)；糖化血红蛋白(HbAlc)试剂盒(瑞士ALEXIS公司，批号YB-R0298c)；甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TCH)试剂盒、高密度脂蛋白(HDL)试剂盒、低密度脂蛋白(LDL)试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批号分别为A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1)；细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、抗Akt抗体、HRP标记山羊抗兔(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G2026、G2002、GB111114、GB23303)；抗p-Akt抗体、抗FoxO1抗体、抗葡萄糖激酶(GCK)抗体、抗胰十二指肠同源盒因子-1(Pdx1)抗体、GAPDH抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为4060、2880、3782、5679、5174)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)[宝生物工程(大连)有限公司，批号AIG2018A]。血糖仪及血糖试纸(美国Abbott公司)；Nanodrop 2000超微量核酸蛋白检测仪(美国Thermo Fisher公司)；荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠按照体质量随机分为正常组(8只)和造模组(50只)，正常组继续给予正常饲料喂养，造模组给予高脂高糖饲料喂养，4周后禁食不禁水12 h，造模组腹腔注射STZ(40 mg/kg)，正常组注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH 4.2)，72 h后禁食不禁水12 h，检测血糖。1周后再次复查，2次空腹血糖(FBG)均大于16.7 mmol/L者为造模成功。

2.2 分组及给药 挑选造模成功的大鼠，按照体质量随机分为模型组，二甲双胍组(200 mg/kg)，白虎加人参汤高、低剂量组(37.8、9.45 g/kg)，每组8只，给药8周，模型组和给药组每天均给予高脂高糖饲料，正常组每天继续给予正常饲料。观察记录给药期间大鼠体质量、FBG及行为状态。

2.3 标本处理与采集 分别在给药第0、2、4、6、8周时，禁食不禁水12 h后，尾静脉取血，检测FBG。腹腔给予10%水合氯醛麻醉，待大鼠完全麻醉，经腹主动脉取血，一部分装于抗凝离心管中，用于检测HbAlc；剩余血装于普通离心管中，3 500 r/min离心15 min，分离上层血清，用于检测其他生化指标。取血后，迅速分离出胰腺组织，称定质量，分离出一部分放入4%多聚甲醛溶液中，用于石蜡切片制备及后续形态学观察；剩余胰腺组织于-80 ℃冻存，用于PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白检测。

2.4 生化指标检测 按照相关试剂盒说明书检测HbAlc、胰岛素(insulin，INS)、TG、TCH、HDL、LDL水平，并计算胰岛素敏感指数(ISI)。

2.5 石蜡切片制备及病理学观察 取固定于4%多聚甲醛溶液中的各组大鼠胰腺组织，用各体积分数乙醇梯度脱水，每级1.5 h，使用二甲苯透明标本，将透明化组织块完全浸没于60～65 ℃石蜡液体中恒温过夜，用熔化的蜡液包埋组织，待冷却成型后，在石蜡切片机上以5 μm厚度连续切片，脱蜡，苏木精-伊红染色，封片。于光学显微镜下观察胰腺组织病理变化。

2.6 RT-qPCR法检测胰腺组织中caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表达 取大鼠胰腺组织100 mg，采用实时荧光定量PCR法检测caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表达，引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，以GAPDH为内参，引物序列见表1。反应条件为预变性95 ℃ 10 min；扩增 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环；熔解曲线反应条件为60 ℃升至95 ℃，0.3 ℃/15 s。使用2-ΔΔCT法计算基因相对表达。

表1 引物序列

2.7 Western Blot法检测胰腺组织Akt、p-Akt、FoxO1、Pdx1、GCK蛋白表达 取大鼠胰腺组织100 mg提取总蛋白和核蛋白，经BCA法定量和蛋白变性后，进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至PVDF转膜后进行封闭，用一抗稀释液分别稀释一抗p-Akt(1∶5 000)、Akt(1∶5 000)、FoxO1(1∶5 000)、Pdx1(1∶5 000)、GCK(1∶5 000)、GAPDH(1∶5 000)，充分覆盖PVDF膜，4 ℃孵育过夜，次日使用TBST洗5次，每次5 min，放入二抗(1∶2 000)溶液中，室温孵育1 h，TBST洗5次，每次5 min，避光现配ECL化学发光液，于暗室中加至PVDF 膜的蛋白面，充分接触，1～2 min后去尽残液，放入暗匣中曝光，曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。将胶片进行扫描，以Photoshop软件整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

2.8 免疫组织化学染色观察FoxO1蛋白表达 胰腺组织切片脱蜡至水，置EDTA缓冲液中微波修复，滴加5% BSA室温封闭30 min，加入一抗FoxO1(1∶400)充分覆盖切片，4 ℃孵育过夜，PBS洗4次，每次5 min，甩干，滴加二抗(1∶400)，甩干，滴加试剂SABC，室温1.5 h，滴加3,3-二氨基联苯胺显色，苏木素复染，水洗3次，每次5 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。可见黄色或棕色沉积即为FoxO1蛋白阳性表达。

3 结果

3.1 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠FBG、INS、HAblc水平的影响 正常组大鼠精神状态良好，皮毛有光泽，空腹血糖正常。如图1A所示，与正常组比较，模型组大鼠FBG升高(P<0.05)；与模型组比较，2周后，阳性药组和白虎加人参汤高剂量组FBG水平降低(P<0.05)，而白虎加人参汤低剂量组在给药4周后，FBG水平降低(P<0.05)，提示白虎加人参汤能够降低2型糖尿病大鼠的FBG。如图1B～1C所示，与正常组比较，模型组大鼠INS水平降低(P<0.05)，HAblc水平升高(P<0.05)；与模型组比较，8周后，各给药组大鼠INS水平升高(P<0.05)，HAblc水平降低(P<0.05)。

3.2 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠ISI的影响 如表2所示，与正常组比较，模型组ISI降低(P<0.05)；8周后，与模型组比较，各给药组ISI均升高(P<0.05)。

表2 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠ISI的影响

3.3 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠胰腺指数的影响 采用STZ造模时，会损伤大鼠的胰腺组织，如图2所示，模型组大鼠胰腺指数低于正常组(P<0.05)；白虎加人参汤干预8周后，大鼠胰腺指数与模型组比较均升高(P<0.05)，提示白虎加人参汤可改善2型糖尿病大鼠的胰腺萎缩。

3.4 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠血脂代谢的影响 如图3所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TCH、LDL水平均升高(P<0.05)，HDL水平降低(P<0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠血清TG、TCH、LDL水平均降低(P<0.05)，白虎加人参汤高剂量组大鼠血清HDL水平升高(P<0.05)，提示白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠的血脂具有改善作用。

3.5 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠胰岛病理组织形态学的影响 正常组大鼠胰岛呈椭圆形，结构规整，胞团大小不一，结构完整、规则、边缘清晰，散布于胰腺腺泡之间，胰岛内β细胞丰富、大小均匀、形态饱满，排列紧密，未发现病理变化；模型组大鼠胰岛形态不规则，边界模糊，结构紊乱，胰岛内β细胞肿胀、变形，细胞质染色变浅；与模型组比较，各给药组大鼠胰岛内β细胞数目明显增加，结构较规整，无明显坏死，胰岛边界清晰，形态结构有所改善，见图4。

3.6 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠胰腺组织凋亡相关基因表达的影响 如图5所示，与正常组比较，模型组大鼠胰腺组织caspase3、Bax/Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠胰腺组织caspase3、Bax/Bcl-2 mRNA表达均降低(P<0.05)，提示白虎加人参汤具有抗2型糖尿病大鼠胰腺组织凋亡的作用。

3.7 白虎加人参汤对2型糖尿病大鼠胰腺组织p-Akt、Akt、Pdx1、FoxO1、GCK蛋白表达的影响 如图6A～6E所示，与正常组比较，模型组大鼠胰腺组织PI3K/Akt/FoxO1信号通路受到抑制，p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表达降低(P<0.05)，而FoxO1的核输出减少，细胞核中FoxO1增多(P<0.05)，活性下降；与模型组比较，8周后，各给药组大鼠胰腺组织p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表达均升高(P<0.05)，FoxO1蛋白表达减少(P<0.05)，促进了FoxO1的核输出。如图6F所示，免疫组化实验同Western blot实验结果一致，提示白虎加人参汤可能是通过影响PI3K/Akt/FoxO1信号通路中的相关蛋白表达来发挥保护胰腺组织的作用。

4 讨论

白虎加人参汤始见于《伤寒杂病论》，由知母、石膏、甘草、粳米、人参组成。生石膏辛甘大寒为君药，专清肺胃之热邪，既可清阳明之内热, 又能滋养肺阴, 与少阴肾经之知母相配, 既可泻无根之肾火, 宣气分之郁热, 又可养阴生津; 知母之辛苦寒凉, 下则润肾燥以滋阴, 上则清肺金而泻火，石膏知母相须为用，加强清热生津的作用；人参为佐，一可升脾气，助运化，资生化之源，二可补元气，人参与石膏相配，石膏得人参能清热补虚，且不伤气阴，人参得石膏可补而不燥，二者相得益彰；粳米生胃津益胃气; 甘草和胃养阴，共奏清热止渴、益气生津之效，为治疗消渴病的有效方药。

目前，胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷被认为是2型糖尿病发病的重要病理生理机制[20]。因此，预防与治疗2型糖尿病的关键是保护胰岛β细胞、减少胰岛β细胞凋亡及增加INS分泌。本实验发现，给予白虎加人参汤8周后，2型糖尿病大鼠血清INS分泌增多，FBG和HAblc水平均下降，ISI升高，并且可改善2型糖尿病大鼠的血脂代谢。为了探究其INS分泌增多的原因，本研究发现，白虎加人参汤可以改善2型糖尿病大鼠的胰岛组织病理变化，其还可以降低凋亡相关因子caspase3和Bax/Bcl-2的mRNA表达，增加胰腺指数，从而保护胰岛β细胞，延缓胰岛β细胞凋亡的进程。

PI3K/Akt信号通路作为一条经典信号通路, 对调控胰岛β细胞的凋亡、增殖，调节INS敏感性，缓解胰岛素抵抗[21]及促进INS分泌[22]等方面具有重要作用。PI3K通过影响Akt磷酸化，来介导胰岛素和多种生长因子对糖代谢的调节及细胞生长、增殖和细胞周期调节等。FoxO1使Akt失去转录活性，抑制胰岛β细胞凋亡[8]，增加胰岛β细胞数目，保护胰岛β细胞。FoxO1调控胰岛β细胞增殖的过程，是Pdx1的负性调节剂，在胰岛β细胞生长和发挥功能中起到关键作用。而Pdx1也是葡萄糖转运子2(GLUT-2)和GCK等与胰岛素释放有关的一组基因转录调控因子。由此可见，PI3K/Akt/FoxOl信号通路对于胰岛β细胞的生长、发育、增殖、凋亡和胰岛素分泌等方面具有重要作用。本研究发现，白虎加人参汤可以提高胰腺组织中的p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表达升高，减少FoxO1蛋白表达，促进了FoxO1的核输出。

综上所述，白虎加人参汤可以降低2型糖尿病大鼠FBG、HAblc水平，促进血清INS分泌及ISI升高，并且可改善2型糖尿病大鼠的血脂代谢，还可降低凋亡相关因子caspase3和Bax/Bcl-2的mRNA表达，增加胰腺指数，改善2型糖尿病大鼠的胰岛组织病理变化，其机制可能是通过调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路发挥作用。