蛇床子素白蛋白纳米粒的制备及其体内药动学研究

辛 娟， 易 华， 李 明， 谈秀凤

(1.黄河科技学院，河南 郑州 450063；2.上海中医药大学，上海 201203)

蛇床子素是从蛇床子Cnidiummonnieri(L.)Cusson中提取出的一种香豆素类活性成分，具有抗心律失常、壮阳、抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗过敏、降血压、抗骨质疏松、增强免疫等药理作用[1-3]，在心脑血管疾病、内分泌系统、神经系统、免疫系统等方面中的应用较多，但该成分溶解度仅为4.65 μg/mL，影响了溶出度[4]，而且胃肠道稳定性差[5]，导致口服吸收生物利用度较低(仅为15.65%)[6]，不利于药效发挥。另外，蛇床子素logP为3.46[7]，脂溶性较高，故提高该成分溶解度、溶出度有利于增加其体内吸收程度。

白蛋白是一种安全的纳米载体材料[8-10]，可提高难溶性药物的溶解度、溶出度、体内稳定性[11-13]，促进药物吸收，并且自身可作为辅料制备冻干制剂。同时，蛇床子素与白蛋白之间具有较强的结合作用，故在一定制剂条件下可形成纳米粒[14]。本实验制备蛇床子素白蛋白纳米粒，并考察其体内药动学，以期为相关新制剂开发提供策略。

1 材料

Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)；安捷伦1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；MS105/A型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；JC-HJ-A型磁力搅拌器(青岛聚创环保集团有限公司)；Master-sizer型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；Z32HK型高速离心机(德国Hermle公司)；KQ-300DB型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；超滤离心管(30 K，美国Pall公司)；BK-FD10S型冻干机(博科控股集团有限公司)；QIMO-DCY-12S型氮气吹扫仪[琪摩(上海)电子科技有限公司]。

蛇床子素对照品(批号110822-201810，纯度99.5%，中国食品药品检定研究院)；蛇床子素原料药(批号20191215，纯度98%，西安佰斯特生物科技有限公司)。牛血清白蛋白(批号190725，纯度≥98%，盐城赛宝生物科技有限公司)。

SD大鼠，雌雄兼具，体质量(250±20)g，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(豫)2016-0001。

2 方法与结果

2.1 白蛋白纳米粒及其冻干粉制备 参考文献[12, 15-16]报道，称取处方量原料药至一定体积无水乙醇中，超声溶解，作为有机相；称取处方量牛血清白蛋白，置于40 mL pH 7.0缓冲液中，600 r/min磁力搅拌溶解，作为水相，将有机相以2 mL/min滴速滴加到水相中，超声处理20 min，加入100 μL 0.2%戊二醛固化12 h，在40 ℃下减压旋蒸1 h，除去无水乙醇，4 ℃、20 000 r/min离心45 min，移弃上清液，加蒸馏水至40 mL，过0.45 μm微孔滤膜，即得白蛋白纳米粒，再将其置于-20 ℃中冰箱冷冻3 d，迅速转移至初始温度为-20 ℃的冷冻干燥机中抽真空后冷冻3 d，即得冻干粉。除不加原料药外，同法制备空白白蛋白纳米粒。

2.2 蛇床子素含量测定

2.2.1 色谱条件 Hypersil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相水-甲醇(60∶40)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长429 nm；进样量20 μL。

2.2.2 线性关系考察 称取20 mg对照品至50 mL量瓶中，甲醇超声溶解后定容，得400 μg/mL贮备液，流动相制成20、10、5、1、0.1、0.05 μg/mL对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=14.148 2X+0.415 3(r=0.999 7)，在0.05～20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液制备 取白蛋白纳米粒1 mL，置于10 mL量瓶中，加入约5 mL甲醇，超声处理2 min以沉淀蛋白，甲醇定容至刻度，取1 mL至10 mL量瓶中，8 500 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 方法学考察 取“2.2.3”项下供试品溶液适量，于0、3、6、9、12、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得蛇床子素峰面积RSD为1.36%，表明溶液在24 h内稳定性良好。取“2.2.3”项下供试品溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得蛇床子素峰面积RSD为0.56%，表明仪器精密度良好。取白蛋白纳米粒适量，按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得蛇床子素峰面积RSD为1.64%，表明该方法重复性良好。取9份白蛋白纳米粒，每份0.5 mL，置于10 mL量瓶中，随机分为3组，分别加入对照品溶液0.5、1、1.5 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得蛇床子素平均加样回收率分别为100.93%、99.37%、99.78%，RSD分别为1.06%、0.63%、1.11%。

2.3 包封率、载药量测定 在超滤离心管(截留分子量8 000～14 000 Da)中加入1 mL白蛋白纳米粒，8 500 r/min离心10 min，HPLC法测定滤液中游离蛇床子素量(m游离)；取白蛋白纳米粒1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，HPLC法测定蛇床子素总量(m总)，计算包封率、载药量，公式分别为包封率=[(m总-m游离)/m总]×100%、载药量=[(m总-m游离)/m总质量]×100%，其中m总质量表示白蛋白纳米粒总质量。

2.4 Box-Behnken响应面法 在课题组前期研究基础上，选择蛇床子素用量(X1)、白蛋白用量(X2)、无水乙醇用量(X3)作为影响因素，包封率(Y1)、载药量(Y2)作为评价指标，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

响应面分析见图1。由图1A～1C可知，随着白蛋白用量增加，包封率呈升高趋势；随着蛇床子素用量增加，包封率呈降低趋势；随着无水乙醇用量增加，包封率先升后降。由图1D～1F可知，随着白蛋白用量增加，载药量呈降低趋势；随着蛇床子素用量增加，载药量呈升高趋势；随着无水乙醇用量增加，载药量先升后降。设置包封率最小值为50%，最大值为100%；载药量最小值为2%，最大值为15%，得到最优工艺为蛇床子素用量29.05 mg，白蛋白用量321.66 mg，乙醇用量7.59 mL，包封率为84.61%，载药量为6.87%，考虑到实际操作性，将其修正为蛇床子素用量29 mg，白蛋白用量322 mg，乙醇用量7.6 mL。

按上述优化工艺平行制备3份白蛋白纳米粒，外观见图2A，测得平均包封率为83.71%，载药量为6.59%，分别与预测值84.61%、6.87%接近；平均Zeta电位为-26.45 mV(图3)，粒径为113.82 nm(图4)，PDI为0.081。冻干粉外观见图2B，可知为片状疏松状态的粉末，加入蒸馏水复溶后平均Zeta电位为-22.61 mV，粒径为153.73 nm，PDI为0.127。

2.5 溶解度测定 取过量原料药、物理混合物(蛇床子素+空白白蛋白纳米粒)、白蛋白纳米粒冻干粉适量，置于烧瓶中，加入10 mL蒸馏水(仍有药物沉淀于底部)，25 ℃、600 r/min磁力搅拌72 h，取上层混悬液，8 500 r/min离心15 min，取上清液，计算溶解度。结果，原料药、物理混合物溶解度分别为4.65、7.83 μg/mL，而白蛋白纳米粒达107.98 μg/mL，是原料药的23.22倍。

2.6 体外释药研究

2.6.1 人工胃液、人工肠液制备 取10 g胃蛋白酶，加400 mL纯化水搅拌溶解；取3.8 mL浓盐酸，加500 mL纯化水，将两者合并后振荡混匀，加5 mL吐温-80，纯化水补至1 000 mL，振荡混匀，即得人工胃液。取磷酸二氢钾6.8 g，加500 mL纯化水，振荡溶解，0.1 mol/L NaOH溶液调节pH至6.8；取胰蛋白酶10 g，加400 mL纯化水，振荡溶解，将两者合并后振荡混匀，加5 mL吐温-80，纯化水补至1 000 mL，振荡混匀，即得人工肠液。

2.6.2 操作过程 取原料药、物理混合物、白蛋白纳米粒冻干粉适量(以蛇床子素计均为5 mg)，5 mL空白释放介质制成混悬液，置于透析袋中(截留分子量8 000～14 000 Da)，取1 000 mL人工胃液，设定温度为37 ℃，转速为100 r/min，于0、0.25、0.5、1、2 h各取样3 mL，并加入同体积的人工胃液；同法考察各样品在人工肠液中的释药情况，取样时间为0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12 h，绘制释药曲线，结果见图5～6。由此可知，白蛋白纳米粒在人工胃液或人工肠液中的累积释放度均高于原料药，在人工胃液中2 h内为44.86%；在人工肠液中8 h内为90.40%，12 h内为93.67%。

2.7 稳定性考察 称取2份白蛋白纳米粒冻干粉，每份0.2 g，置于50 mL人工胃液或人工肠液中(4 ℃)，在37 ℃下于0、0.5、1、2、3、4、5 h测定粒径，结果见图7。由此可知，白蛋白纳米粒冻干粉粒径在蒸馏水中的变化程度最小，5 h后仍小于200 nm；在人工胃液中2 h后粒径增加至457.92 nm；在人工肠液中2 h后粒径增加至352.17 nm，4 h后接近1 000 nm。

2.8 体内药动学研究

2.8.1 分组、给药与采血 取禁食1 d的大鼠18只(其间可自由饮水)，随机分为3组，每组6只，分别灌胃给予原料药、物理混合物(原料药+空白白蛋白纳米粒)、白蛋白纳米粒冻干粉的混悬液(用0.5%CMC-Na溶液配制，蛇床子素质量浓度为3.5 mg/mL)，剂量均为30 mg/kg，乙醚麻醉后于0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶取血各约0.2～0.3 mL，置于肝素化离心管中，振荡混匀，3 000 r/min离心2 min，分离血浆，密封，保存于-20 ℃冰箱中。

2.8.2 血浆处理 将大鼠血浆在室温下解冻后精密吸取100 μL，置于离心管中，加入内标溶液(精密称取丹皮酚对照品20.80 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解定容并稀释至400 ng/mL，即得)100 μL、甲醇3 mL，密封涡旋3 min，6 500 r/min离心8 min，取上层有机相，氮气缓慢吹干，100 μL甲醇复溶，6 500 r/min离心8 min，进样分析。

2.8.3 线性关系考察 取“2.2.2”项下贮备液适量，甲醇稀释至1 600、1 200、800、200、50、20 ng/mL，分别精密吸取100 μL至离心管中，45 ℃氮气缓慢吹干，加入100 μL空白血浆，作为血浆对照品溶液，按“2.8.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度(Y)对其与内标峰面积比值(X)进行回归，得方程为Y=143.68X+3.12(r=0.994 6)，在20～1 600 ng/mL范围内线性关系良好。

2.8.4 专属性考察 取空白血浆、血浆对照品溶液(20 ng/mL)、给药12 h后血浆适量，按“2.8.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图8，可知该方法专属性良好。

2.8.5 方法学考察 取20、800、1 600 ng/mL血浆对照品溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得对照品、内标峰面积比值RSD分别为12.07%、7.66%、9.18%，表明仪器精密度良好。取800 ng/mL血浆对照品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得对照品、内标峰面积比值RSD为6.04%，表明样品在24 h内稳定性良好。制备800 ng/mL血浆对照品溶液，平行6份，按“2.8.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得对照品、内标峰面积比值RSD为10.43%，表明该方法重复性良好。取20、800、1 600 ng/mL血浆对照品溶液适量，按“2.8.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得蛇床子素平均加样回收率分别为93.59%、89.41%、92.25%，RSD分别为9.17%、5.42%、7.01%。

2.8.6 结果分析 取含原料药、物理混合物、白蛋白纳米粒的血浆适量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，采用DAS2.0药动学软件自动拟合数据，绘制血药浓度-时间曲线，结果见图9、表4。由此可知，与原料药比较，物理混合物Cmax、tmax、Cmax、AUC0～t无显著差异(P>0.05)，表明空白白蛋白纳米粒对蛇床子素基本无促吸收作用；与原料药、物理混合物比较，白蛋白纳米粒Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，tmax缩短(P<0.05)，口服生物利用度增加至3.29倍。

表4 蛇床子素主要药动学参数

3 讨论

蛇床子素、白蛋白用量会影响白蛋白纳米粒包封率、载药量，故结合前期预实验需要对两者(20～40、300～600 mg)进行优化。随着乙醇用量增加，体系依次经历澄清、乳光、浑浊、沉淀等变化，而乳光至浑浊是初步形成纳米粒的最佳区间，故其不足时去溶剂化效果较差，影响纳米粒形成[17]，但过多时又会导致白蛋白直接沉淀，结合预实验，确定该参数优化区间为5～10 mL。

本实验发现，原料药未能全部释放，可能与体外释药实验时间不够长、本身颗粒较大等原因有关；将其制成白蛋白纳米粒后可增加亲水性[9-11]、溶解度、比表面积，从而加快药物释放。白蛋白纳米粒可大大提高药物溶解度，可能与后者比表面积激增有关[13]，并且文献[9-10, 17-18]报道，药物在白蛋白纳米粒中以无定形形式存在，故可能也会对其溶解度提高产生积极影响。

药动学研究结果显示，物理混合物对蛇床子素的药动学参数有一定改变，但程度远小于白蛋白纳米粒，而白蛋白纳米粒tmax缩短，可能是由于在复杂胃肠道环境中酶解对其产生破坏作用，从而使药物快速释放所致[19-20]；Cmax、AUC0～t升高，可能是因为该剂型可增加药物亲水性，提高溶解度、溶出度，从而解决了吸收瓶颈，最终口服吸收生物利用度增加至3.29倍。今后，可研究蛇床子素白蛋白纳米粒的注射药动学、药效[21]、质量标准等，以期为其进一步开发利用提供更全面的实验数据及参考资料。