金沸草化学成分的研究及其对HaCat 细胞的影响

董明亮 马新苹 郭金兰 甘才斌 张步鑫

（1.新乡市中心医院， 新乡医学院第四临床学院， 河南 新乡453000； 2.河南省中医院， 河南中医药大学第二附属医院， 河南 郑州450002）

金沸草为菊科植物旋覆花Inula japonicaThunb.的干燥地上部分［1］，分布于海拔150～500 m 的丘陵、荒地、路旁、山地密林间。金沸草味咸，性温，具有疏肝气、化痰饮、消肿毒的功效［2］。其主要化学成分为萜类、黄酮类、烯酮、醌类、有机酸等［3］。金沸草具有抗真菌、保肝、抗肿瘤、抗衰老、保护神经等活性［4⁃5］。对金沸草有效部位进行分离鉴定出15 个化合物，均为首次从金沸草中分离得到，其中化合物1、11、13、15 对角质形成细胞株（HaCat 细胞）具有不同程度的抑制作用。

1 材料

Thermofisher DQ 型质谱仪（美国Thermo Fisher公司）；Bruker QA⁃500P 型超导核磁共振谱（德国Bruker 公司）；KTH⁃163 型旋转蒸发仪（郑州予达仪器有限公司）；SephadeX LH⁃20 凝胶（瑞典Pharmacia 公司）；HBS⁃1096A 型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；PAUT1250NA 型全自动离心机（蚌埠谷雨分离机械制造有限公司）；BSA6202S⁃CW 型电子天平（德国赛多利斯公司）；DMSO 培养基（北京安诺伦生物科技有限公司）。所用试剂均为分析纯。

金沸草购自新乡市中心医院，经河南省中医院张步鑫副教授鉴定为金沸草Inula japonicaThunb.。

2 提取与分离

取金沸草33.7 kg，回流提取3次，回收溶剂得金沸草浸膏4.7 kg。依次用石油醚、二氯甲烷、丙酮和正丁醇萃取，浓缩至浸膏，得石油醚层（Fr.A）306.5 g、二氯甲烷层（Fr.B）283.6 g、丙酮层（Fr.C）203.8 g、正丁醇层（Fr.D）236.5 g。Fr.B4 经硅胶柱色谱，以石油醚⁃丙酮（90∶10～50∶50～10∶90）梯度洗脱，得到Fr.B4⁃1～Fr.B4⁃7。Fr.B4⁃4 经硅胶柱色谱，以石油醚⁃乙酸乙酯（30∶70）洗脱，得化合物1（12 mg）、9（23 mg）、10（18 mg）。Fr.B7 经硅胶柱色谱，以石油醚⁃乙酸乙酯（70∶30～50∶50～30∶70）梯度洗脱，得到Fr.B7⁃1～Fr.B7⁃6。Fr.B7⁃5 经Sephadex LH⁃20 柱色谱，以二氯甲烷⁃甲醇（1∶3）洗脱，得化合物8（16 mg）、12（24 mg）。Fr.B9 经硅胶柱色谱，以二氯甲烷⁃乙酸乙酯（60∶40～40∶60）梯度洗脱，得Fr.B9⁃1～Fr.B9⁃7。Fr.B9⁃3 经Sephadex LH⁃20柱色谱，以二氯甲烷⁃甲醇（1∶3）洗脱，得化合物11（17 mg）、13（29 mg）。取Fr.C 过硅胶色谱柱，以石油醚⁃丙酮（80∶20～0∶100）梯度洗脱，得到Fr.C1～Fr.C9。Fr.C3 经硅胶柱色谱，以二氯甲烷⁃乙酸乙酯（90∶10～70∶30～10∶90）梯度洗脱，得到Fr.C3⁃1～Fr.C3⁃9。Fr.C3⁃4 经硅胶柱色谱，以二氯甲烷⁃丙酮（50∶50）洗脱，得化合物2（14 mg）、5（17 mg）。Fr.C3⁃7 经Sephadex LH⁃20柱色谱，以二氯甲烷⁃甲醇（1∶3）洗脱，得化合物15（17 mg）、14（21 mg）。Fr.C8 经硅胶柱色谱，以二氯甲烷⁃丙酮（80∶20～50∶50～20∶80）梯度洗脱，得到Fr.C8⁃1～Fr.C8⁃8。Fr.C8⁃3 经硅胶柱色谱，以二氯甲烷⁃乙酸乙酯（50∶50）洗脱，得化合物7（9 mg）、6（25 mg）。Fr.C8⁃6 经Sephadex LH⁃20 柱色谱，以二氯甲烷⁃甲醇（1∶3）洗脱，得化合物3（22 mg）、4（13 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：紫色粉末，ESI⁃MSm／z：765.1［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃2′），7.59（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H⁃6′），6.74（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃5′），6.27（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃8），6.05（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃6）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：104.2（C⁃1），l59.2（C⁃2），134.7（C⁃3），180.6（C⁃4），162.5（C⁃5），98.4（C⁃6），165.3（C⁃7），95.4（C⁃8），161.2（C⁃9），103.5（C⁃10），122.8（C⁃1′），116.8（C⁃2′），146.4（C⁃3′），150.4（C⁃4′），117.3（C⁃5′），124.1（C⁃6′）。以上数据与文献［6］ mutabiloside 数值基本一致。

化合 物2：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：324.8［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：12.79（1H，s，5⁃OH），9.51（4H，m，6，7，3′，4′⁃OH），7.38（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H⁃6′），7.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃2′），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃5′），6.59（1H，s，H⁃3），6.48（1H，s，H⁃8）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：117.1（C⁃1），164.3（C⁃2），101.7（C⁃3），177.2（C⁃4），152.4（C⁃5），131.8（C⁃6），151.8（C⁃7），94.2（C⁃8），151.8（C⁃9），103.2（C⁃10），118.5（C⁃1′），110.4（C⁃2′），146.8（C⁃3′），150.2（C⁃4′），115.3（C⁃5′），119.2（C⁃6′）。以上数据与文献［7］ 6⁃羟基木犀草素数值基本一致。

化合 物3：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：351.4［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：14.73（1H，s，5⁃OH），7.73（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H⁃6′），7.12（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃5′），7.05（1H，s，H⁃3），6.76（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃8），6.58（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃6），3.79（3H，s，7⁃OCH3），3.74（3H，s，3′⁃OCH3），3.71（3H，s，4′⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：131.5（C⁃1），165.2（C⁃2），104.7（C⁃3），181.6（C⁃4），161.9（C⁃5），102.4（C⁃6），163.8（C⁃7），92.5（C⁃8），157.4（C⁃9），105.7（C⁃10），123.6（C⁃1′），108.1（C⁃2′），154.7（C⁃4′），113.8（C⁃5′），119.2（C⁃6′），55.4（7⁃OCH3），54.2（3′⁃OCH3），56.5（4′⁃OCH3）。以上数据与文献［8］ 木犀草素⁃7，3′，4′⁃三甲醚数值基本一致。

化合 物4：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：397.2［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：13.47（1H，s，5⁃OH），9.48（1H，brs，4′⁃OH），7.41（2H，s，H⁃2′，6′），7.18（1H，s，H⁃3），6.92（1H，s，H⁃8），4.07（3H，s，7⁃OCH3），3.84（6H，s，3′，5′⁃OCH3），3.71（3H，s，6⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：134.2（C⁃1），163.7（C⁃2），104.2（C⁃3），181.7（C⁃4），151.6（C⁃5），128.5（C⁃6），159.3（C⁃7），90.2（C⁃8），151.1（C⁃9），102.8（C⁃10），119.6（C⁃1′），103.7（C⁃2′），149.5（C⁃3′），139.2（C⁃4′），127.3（C⁃5′），103.7（C⁃6′），59.3（6⁃OCH3），57.2（7⁃OCH3），57.2（3′，5′⁃OCH3）。以上数据与文献［9］ 5，4′⁃二羟基⁃6，7，3′，5′⁃四甲氧基黄酮数值基本一致。

化合物5：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：337.4［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：14.17（1H，s，5⁃OH），9.91（1H，brs，4′⁃OH），7.81（2H，d，H⁃2′，6′），6.93（2H，d，H⁃3，5′），6.71（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃8），6.29（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃6），3.94（3H，s，7⁃OCH3），3.81（3H，s，3′⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：146.2（C⁃1），164.7（C⁃2），104.6（C⁃3），174.9（C⁃4），159.2（C⁃5），98.1（C⁃6），166.3（C⁃7），91.4（C⁃8），156.8（C⁃9），103.2（C⁃10），120.6（C⁃1′），109.5（C⁃2′），147.2（C⁃3′），149.7（C⁃4′），114.7（C⁃5′），119.8（C⁃6′），55.8（7⁃OCH3），54.6（3′⁃OCH3）。以上数据与文献［9］ 5，4′⁃二羟基⁃7，3′⁃二甲氧基黄酮数值基本一致。

化合物6：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：381.2 ［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：10.93（1H，s，⁃OH），6.84（2H，s，H⁃3，6′），6.52（1H，s，H⁃3′），6.48（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃8），6.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃6），4.03（6H，s，2′，5′⁃OCH3），3.97（3H，s，4′⁃OCH3），3.88（3H，s，7⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：125.2（C⁃1），161.8（C⁃2），109.2（C⁃3），127.3（C⁃4），161.8（C⁃5），97.2（C⁃6），166.1（C⁃7），91.3（C⁃8），110.4（C⁃1′），149.8（C⁃2′），96.8（C⁃3′），152.5（C⁃4′），153.6（C⁃5′），113.7（C⁃6′），101.6（C⁃4a），157.3（C⁃8a），55.8（7⁃OCH3），55.8（2′⁃OCH3），55.1（4′⁃OCH3），54.9（5′⁃OCH3）。以上数据与文献［10］ 5⁃羟基⁃7，2′，4′，5′⁃四甲氧基黄酮数值基本一致。

化合物7：无色针晶，ESI⁃MSm／z：188.7［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：11.46（1H，s，2⁃OH），8.27（1H，s，4⁃OH），6.31（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃5），6.18（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃3），2.58（3H，s，1⁃OCH3），2.51（3H，s，6⁃CH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：109.8（C⁃1），166.8（C⁃2），100.2（C⁃3），161.6（C⁃4），113.5（C⁃5），143.5（C⁃6），32.8（1⁃COCH3），24.6（6⁃CH3）。以上数据与文献［11］ 2，4⁃二羟基⁃6⁃甲基苯乙酮数值基本一致。

化合物8：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：201.3［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.65（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃7），7.41（2H，d，J＝7.8 Hz，H⁃2，6），6.73（2H，d，J＝7.8 Hz，H⁃3，5），6.29（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃8），3.78（3H，s，9⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：128.3（C⁃1），130.2（C⁃2），116.2（C⁃3），162.5（C⁃4），116.2（C⁃5），130.2（C⁃6），145.1（C⁃7），115.2（C⁃8），168.1（C⁃9），52.3（9⁃OCH3）。以上数据与文献［12］ 对羟基肉桂酸甲酯数值基本一致。

化合 物9：黄色针晶，ESI⁃MSm／z：215.2［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：10.20（1H，brs，4⁃OH），7.71（2H，d，J＝7.8 Hz，H⁃2，6），6.79（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃7），6.71（2H，d，J＝7.8 Hz，H⁃3，5），5.63（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃8），3.92（1H，q，J＝7.8 Hz，H⁃1′），1.05（3H，t，J＝7.8 Hz，H⁃2′）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：124.7（C⁃1），133.5（C⁃2），113.5（C⁃3），142.7（C⁃4），113.5（C⁃5），133.7（C⁃6），142.6（C⁃7），114.2（C⁃8），165.8（C⁃9），59.3（C⁃1′），13.8（C⁃2′）。以上数据与文献［13］ 对羟基肉桂酸乙酯数值基本一致。

化合物10：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：189.2［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：8.03（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃3，5），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃2，6），4.41（1H，q，J＝7.8 Hz，H⁃2′），1.42（1H，t，J＝7.8 Hz，H⁃3′）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：123.6（C⁃1），131.8（C⁃2），114.9（C⁃3），159.4（C⁃4），114.9（C⁃5），131.8（C⁃6），168.2（C⁃1′），59.6（C⁃2′），15.1（C⁃3′）。以上数据与文献［14］ 对羟基苯甲酸乙酯数值基本一致。

化合物11：白色粉末，ESI⁃MSm／z：401.2［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃6），6.76（2H，d，J＝7.8 Hz，H⁃17，21），6.72（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃14），6.59（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃12），6.56（2H，d，J＝7.8 Hz，H⁃18，20），6.37（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃4），5.79（1H，s，H⁃9）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：199.3（C⁃1），109.3（C⁃2），168.1（C⁃3），106.2（C⁃4），164.1（C⁃5），112.7（C⁃6），141.6（C⁃7），197.2（C⁃8），54.3（C⁃9），102.4（C⁃10），160.2（C⁃11），108.3（C⁃12），156.8（C⁃13），109.6（C⁃14），142.8（C⁃15），129.4（C⁃16），131.2（C⁃17），115.4（C⁃18），158.3（C⁃19），115.4（C⁃20），131.2（C⁃21）。以上数据与文献［15］ diptoindonesin D 数值基本一致。

化合物12：白色粉末，ESI⁃MSm／z：245.3［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.48（2H，m，H⁃3），7.69（2H，m，H⁃4），3.96（2H，m，H⁃5），1.17（3H，t，J＝7.8 Hz，H⁃6）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：159.2（C⁃1），129.4（C⁃2），130.6（C⁃3），129.1（C⁃4），69.3（C⁃5），19.1（C⁃6）。以上数据与文献［16］ 邻苯二甲酸二乙酯数值基本一致。

化合物13：黄色油状物，ESI⁃MSm／z：669.4［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：13.57（1H，s，5⁃OH），7.21（3H，m，H⁃2′，6′，7‴），7.09（1H，brs，H⁃2‴），6.94（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃6‴），6.71（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃5′），6.68（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃5‴），6.61（1H，s，H⁃3），6.35（1H，s，H⁃6），6.18（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃8‴），4.74（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃1″），3.68（3H，s，3⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：141.2（C⁃1），163.6（C⁃2），101.5（C⁃3），181.7（C⁃4），157.2（C⁃5），101.5（C⁃6），1643.6（C⁃7），108.3（C⁃8），157.2（C⁃9），108.3（C⁃10），119.4（C⁃1′），118.6（C⁃2′），144.2（C⁃3′），150.8（C⁃4′），115.7（C⁃5′），112.6（C⁃6′），77.2（C⁃1″），69.5（C⁃2″），71.3（C⁃3″），69.2（C⁃4″），80.3（C⁃5″），60.8（C⁃6″），126.7（C⁃1‴），114.6（C⁃2‴），147.1（C⁃3‴），149.3（C⁃4‴），114.6（C⁃5‴），120.6（C⁃6‴），145.7（C⁃7‴），115.3（C⁃8‴），164.9（C⁃9‴），54.8（3⁃OCH3）。以上数据与文献［17］ 7⁃O⁃feruloylorientin 数值基本一致。

化合物14：黄色粉末，ESI⁃MSm／z：381.2［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.02（2H，d，J＝6.8 Hz，H⁃2′，2″），6.91（4H，m，H⁃6′，6″，5′，5″），4.73（2H，d，J＝4.8 Hz，H⁃2，6），3.92（8H，m，H⁃4β，8β），3.24（2H，m，H⁃1，5）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：134.1（C⁃1），112.3（C⁃2），151.3（C⁃3），148.2（C⁃4），115.4（C⁃5），119.3（C⁃6），86.2（C⁃7），56.1（C⁃8），73.4（C⁃9），134.1（C⁃1′），112.3（C⁃2′），151.3（C⁃3′），148.2（C⁃4′），115.4（C⁃5′），119.3（C⁃6′），86.2（C⁃7′），56.1（C⁃8′），73.4（C⁃9′）。以上数据与文献［18］ pinoresinol 基本一致。

化合物15：白色粉末，ESI⁃MSm／z：263.1［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.63（1H，d，J＝9.6 Hz，H⁃9），7.38（1H，d，J＝9.6 Hz，H⁃10），7.27（1H，d，J＝9.6 Hz，H⁃7），7.24（1H，d，J＝9.6 Hz，H⁃8），7.08（1H，dd，J＝9.6，4.8 Hz，H⁃6），6.75（1H，d，J＝9.6 Hz，H⁃1），6.62（1H，d，J＝9.6 Hz，H⁃3），3.94（3H，s.，4⁃OCH3）；13C⁃NMR（CDCl3，150 MHz）δ：112.3（C⁃1），158.2（C⁃2），102.7（C⁃3），155.1（C⁃4），130.1（C⁃5），113.8（C⁃6），155.4（C⁃7），119.3（C⁃8），128.1（C⁃9），126.1（C⁃10），116.5（C⁃4a），138.2（C⁃8a），136.1（C⁃10a），122.1（C⁃4β），59.1（4⁃OCH3）。以上数据与文献 ［19］moscatin 基本一致。

4 化合物对HaCat 细胞的影响

取2022 年1～2 月在新乡市中心医院确诊的寻常型银屑病患者15例，经患者知情同意，通过环钻取上臂外侧皮损组织，经中性蛋白酶分离获取原代角质形成细胞，在培养基中孵育，得到第二代角质形成细胞株（HaCat 细胞）。通过MTT 法［20］检测化合物对HaCat 细胞的影响，取96 孔板，每孔加入约10 000 个HaCat 细胞，分别加入15 μL 化合物1～15（1、4、8 mg／L）、地塞米松（1、4、8 mg／L）、无血清培养基（设为对照组），在培养箱中培养24 h，每孔加入MTT 试剂继续培养4 h吸弃上清液，加入DMSO 后轻轻振荡使结晶溶解。采用酶标仪检测，计算细胞存活率。与对照组比较，化合物1、13、11、15 对HaCat 细胞具有抑制作用（P＜0.05），见表1。

表1 各化合物对HaCat 细胞存活率的影响（，n＝3）Tab.1 Effects of various compounds on HaCat cells viability（，n＝3）

表1 各化合物对HaCat 细胞存活率的影响（，n＝3）Tab.1 Effects of various compounds on HaCat cells viability（，n＝3）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

5 讨论

金沸草为临床常用药物，外用具有解毒消疮的作用。不同品种金沸草可明显减轻炎性细胞对疮疡模型豚鼠受损组织皮肤的浸润，促进皮肤表面的疮疡愈合［21］。本研究从金沸草中分离鉴定出15 个化合物，均为首次从金沸草中分离得到。化合物1、11、13、15 表现出不同程度的抑制HaCat 细胞增殖活性作用。本研究丰富了金沸草化学成分的资料库，为探求抑制皮损部位的角质形成细胞的新药开发提供参考。