同型半胱氨酸水平及MTHFR C677T基因多态性与脑卒中关系分析

张剑，张娟，鲁凤荣，唐中玉，焦淑芬，程丽娟，韩利

脑卒中是由于血管原因引起的中枢神经系统神经缺陷，具有高发病率、高死亡率、高复发率、高致残率的特点，严重影响人们的生活质量，已成为全球性公共卫生问题[1]。近年来，有多项研究指出高同型半胱氨酸血症症（hyperhomocystinemia，HHcy）与脑卒中的发生密切相关[2,3]。Hcy的浓度取决于遗传因素和环境因素之间的相互作用。浓度升高可导致血管内皮损伤、平滑肌增生和凝血异常，从而引起动脉粥样硬化和血栓形成，可增加脑卒中的风险。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）编码的N5、N10 是Hcy 代谢的关键控制酶[4]，MTHFR 多态性是677位的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）被取代，导致丙氨酸在氨基酸222 处转化为缬氨，C677T 多态性与酶活性降低有关，导致Hcy 升高[5]。目前研究较多的是MTHFR 基因突变为C677T 点突变，其频率分布受人种、地域等因素的影响较大，并且其多态性与脑卒中的关系目前国内外研究还存在争议。本研究拟调查脑卒中人群和健康人群血清总Hcy 水平，MTHFR C677T 基因多态性是否存在差异，结合个体Hcy 水平及MTHFR C677T 基因多态性及对脑卒中进行风险评估，为脑卒中的防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2020年10月至2021年4月，在某三甲医院神经内科招募脑卒中患者236 例为病例组，其中男135 例，女81 例；平均年龄（63.2±12.8）岁。纳入标准：经临床诊断，头颅MRI或CT扫描确诊为脑卒中，符合1995年第四届全国脑血管会议诊断标准[6]。另选择同期在本院门诊体检的健康人群164 例为对照组，其中男90 例，女74 例；平均年龄（62.6±13.3）岁。2 组均排除脑出血、心房颤动、甲状腺功能亢进、心源性卒中、静脉血栓形成、外周血管疾病、肝脏疾病或肾脏疾病患者。本研究方案通过医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血浆Hcy 测定 受试者禁食水12 h，晨起采集空腹血2 mL，置于EDTA 抗凝试管中，于4 ℃下分离血浆，使用Hcy 试剂（北京九强生物技术股份有限公司）通过酶循环测定法检测Hcy 水平。Hcy正常范围为5～15 μmol/L，＞15 μmol/L 是HHcy 的指征。

1.2.2 MTHFR 的基因分型 使用苯酚-氯仿法从EDTA 抗凝的2 mL 外周静脉血中提取基因组DNA。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对MTHFR 基因多态性进行基因分型。使用以下引物对扩增DNA：5'-TGAAGGAG AAGGTGTCTGCGGGA-3'（有义）和5'-AGGACGG TGCGGTGAGAGTG-3'（反义）。PCR混合物（25 μL）含有2.5 μL STR 缓冲液（MgCl2，dNTP 和10×缓冲液），有义和反义引物各2.5 μL，0.4 μL TaqDNA聚合酶（购于上海宝生公司），使用ddH2O将1.5 μL基因组DNA总体积调节至25μL，扩增如下进行：94 ℃预变性2 min；然后进行40 个循环，94 ℃变性30 s，62 ℃变性30 s，72 ℃变性30 s；72 ℃延伸5 min。用限制酶Hinf I（Promega Corp，Madison）消化PCR 产物。通过混合10 μL PCR产物，0.5 μL HinfI，2.0 μL缓冲液R 和7.5 μL ddH2O 制备20 μL 的反应混合物。将反应混合物在37 ℃下温育3 h。然后，通过在2%琼脂糖凝胶上在100 V 电泳30 min 分离PCR片段。没有限制酶位点的野生型（CC）基因型产生198 bp 片段。杂合（CT）基因型产生2个片段：198 bp和175 bp，纯合突变体（TT）产生175 bp片段。

1.2.3 DNA测序分析 为验证PCR-RFLP的基因分型结果，随机选择20例不同基因型的受试者进行DNA测序分析。所有基因型与第一轮PCR-RFLP基因分型获得的基因型相同。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0软件分析数据，计量资料以（均数±标准差）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。采用Hardy-Weinberg平衡定律计算各等位基因频率数据分布可靠性。

2 结果

2.1 2组MTHRF C677T基因型检测结果

病例组MTHFR 基因TT 型及T 等位基因等位基因频率均高于对照组（P＜0.05），CC 型及C 等位基因均低于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 各组MTHFR基因及等位基因频率分布[例(%)]

2.2 病例组MTHFR基因分布频率

病例组MTHFR等位基因频率分布符合Hardly-Weinberg遗传平衡定律（χ2=2.782，P=0.249），数据来自同一遗传群体，见表2。

表2 病例组MTHFR C677T基因Hardly-Weinberg遗传平衡分析

2.3 MTHFRC667T不同基因型和Hcy水平关系

不同MTHFRC667T基因型中，病例组的Hcy浓度显著高于对照组（均P＜0.01）；不同基因人群Hcy 浓度不同，TT 型最高，CT型次之，CC型最低，提示T等位基因突变可能会引起Hcy升高（P＜0.01），见表3。

表3 2组不同MTHFRC667T基因型的Hcy水平比较（μmol/L，±s）

表3 2组不同MTHFRC667T基因型的Hcy水平比较（μmol/L，±s）

组别对照组病例组t值P值例数164 236 CC 10.49±4.72 14.59±4.16 5.370 0.005 CT 10.09±3.78 16.30±4.05 10.970 0.001 TT 17.67±5.06 26.90±10.37 5.810 0.005

3 讨论

脑卒中已成为我国居民首要死亡原因，据预测，2030年脑卒中发生率比2010年增加50%[7]。随着我国人口老龄化的加剧，脑卒中日益成为危害居民健康的问题之一，造成严重的社会经济负担，因此，探索脑卒中预防及治疗新手段至关重要。脑卒中发生与高血压、血脂异常、肥胖、饮食、吸烟、饮酒、缺乏体育锻炼等因素有关。随着精准医学的发展，遗传因素越来越受重视。MTHFR 是叶酸代谢的主要酶之一，将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸[8]，5-甲基四氢叶酸作用于Hcy与甲硫氨酸的再甲基化反应。MTHFR C677T多态性与血浆HCY水平升高有关[9]，METHFR基因677位点上有C/C、C/T、T/T3种分型，其中TT酶活性比CC酶活性低55%，酶活性的降低导致Hcy浓度的升高。Hcy 浓度增加会导致血管内皮的损伤、血管平滑肌增殖、凝血因子的激活影响纤溶酶原激活物抑制剂的表达，从而抑制硫酸化肝素，血栓调节蛋白表达和组织型纤溶酶原激活物合成的合成，其可导致血小板聚集引起脑卒中的发生[10]。有研究指出Hcy浓度增高，是血栓形成的重要因素之一，排除混杂因素后，Hcy浓度增加5 μmol/L，脑卒中风险增加59%[11,12]。

本研究中共检测出3 种MTHFR 基因型分别是：CC 型、CT型、TT型。卒中组MTHFR基因TT型及T等位基因频率均高于对照组（P＜0.05），CC 型及C 等位基因均低于对照组（P＜0.01）。说明脑卒中患者中TT型基因及T等位基因比例高于健康人群，而CC型基因及C等位基因低于健康人群，提示TT型基因人群是可能脑卒中高发人群。国外学者对于MTHFR C677T与脑卒中的风险已有研究，Li等[13]纳入300例脑卒中患者和216例对照者，结果显示TT 型患者脑卒中发生的风险是CC 型的2.15 倍。翁秋燕等[14]分析78 例脑卒中患者和82 例非卒中人群的基因分型，结果显示TT型患者脑卒中脑卒中风险是CC型的2.717 倍。上述结果与本研究结果相一致。但也有研究发现MTHFR C677T基因与脑卒中的发生没有相关性[15]，这可能与入组人群差异有关。

病例组和对照组的MTHFR基因C677T基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，表明本研究对象具有人群代表性。本研究中TT型基因人群中Hcy水平高于CT和CC基因型（P＜0.01），说明Hcy与MTHFR C677T多态性密切相关，但作用机制尚不明确，可能是677位的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）取代导致丙氨酸在氨基酸222 处转化为缬氨酸，然后降低MTHFR 酶活性，参与Hcy新陈代谢。

本研究证实Hcy 水平升高与脑卒中相关，MTHFR C677T多态性可能与遗传因素相关，综合考虑患者Hcy水平和基因分型，对脑卒中的防治发生意义重大。本研究由于样本量较小，单中心研究，结果可能存在局限性，将来开展大样本、多中心研究以期得到更为精确的结果。