显脉旋覆花花序中化学成分分析及其抗补体活性研究

龙 伟， 温芝琪， 吴 东， 黄玉林， 李梦楚， 龚建平*， 刘 圆， 薛敬民，黄文平*

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.山东省泰安荣军医院，山东 泰安 271000；4.华北理工大学，河北 唐山 063210)

显脉旋覆花为菊科植物显脉旋覆花InulanervosaWall. Ex DC 的干燥根及根茎[1]，富含多种维生素和矿物质[2]，根主要含油类成分[3]，可作为防腐剂、杀菌剂、肝功能试剂等[4]，全株无明显毒性，并具有平喘祛痰、抗炎抑菌、抗氧化的作用[3,5-8]，但已有文献主要针对根[9-11]，鲜有涉及花序。因此，本实验采用UPLC-QTOF-MS/MS 法对显脉旋覆花花序化学成分进行分析，同时对其进行抗补体活性评价，以期初步评价该植物增加免疫力的功效，并为其未来作为食品资源的可能性提供依据。

1 材料

LC-30A 超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Triple-TOF 5600高分辨质谱仪，配置ESI 离子源、Analyst 1.6数据处理软件、Peak View数据处理软件(美国AB SCIEX 公司)；HC-3018R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Millipore-Simplicity 超纯水处理系统(德国默克密理博公司)；KQ-400DB型超声清洗机(巩义市予华仪器有限责任公司)；AL204 型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

绿原酸(批号110768-200504)、咖啡酸(批号110885-201703)、大黄素(批号 110756-201913)、槲皮素(批号100081-201610)对照品均购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸(批号BCY-190219)、隐绿原酸(批号BCY-190315)、东莨菪苷(批号BCY-190822)、木犀草素-3,7-二-O-葡萄糖苷(批号BCY-181103)、旋覆花内酯(批号BCY-191025)、3,5-二咖啡酸(批号BCY-190906)对照品均购于江西佰草源生物科技有限公司。显脉旋覆花干燥花序经江西中医药大学龚建平教授鉴定为菊科植物显脉旋覆花InulanervosaWall.的花序。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 UHPLC-QTOF-MS/MS 分析

2.1.1 色谱 Agilent Poroshell 120 C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0.01～4 min，2%B；4～6 min，2%～5%B ；6～10 min，5%～10%B；10～22 min，10%～18%B；22～32 min，18%～25%B；32～42 min，25%～70%B；42～52 min，70%～2%B；52～55 min，2%B)；体积流量0.25 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾电离源(ESI)，负离子模式；质量扫描范围m/z100 ～1 200；喷雾电压 -4 500 V；雾化气温度600 ℃；气帘气172.36 kPa；雾化气和辅助气344.74 kPa；去簇电压-100 V；TOF-MS-IDA-MS/MS法采集数据，TOF/MS一级预扫描、触发的二级扫描TOF/MS/MS 离子累积时间分别为500、200 ms；CE碰撞能量-35 eV。

2.2 对照品溶液制备 精密取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、东莨菪苷、槲皮素、大黄素、木犀草素-3,7,-二-O-葡萄糖苷、旋覆花内酯对照品适量，甲醇制成0.05 mg/mL溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 精密称取粉末(过四号筛)0.2 g，加入70%甲醇25 mL，称定质量，回流提取30 min，放冷，滤过，12 000 r/min离心，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 抗补体活性测定 参照文献[12]报道的方法进行。

3 结果

3.1 化学成分鉴定 总离子流图见图1，具体信息见表1。

表1 显脉旋覆花花序中化学成分

3.2 酚酸类成分分析 咖啡酸，分子式为C9H8O4，负离子模式下m/z179.034 7；二级碎片离子峰m/z161.038 0、135.045 6、134.037 3、107.051 1，其中m/z161.038 0比母离子少18 Da，为2个羟基缩合脱水所致；m/z135.045 6比母离子少44Da，为咖啡酸母核失去CO2的碎片，再进一步失去CO，得到m/z107.051 1的碎片离子，裂解途径见图2。

3.3 黄酮类成分分析 木犀草素-3,7-二-O-葡萄糖苷，分子式为C27H30O16，负离子模式下m/z609.185 4；二级碎片离子峰m/z447.097 0、285.041 1、257.027 5，其中m/z447.097 0比母离子少162 Da，为母核失去1个葡萄糖所致；m/z285.041 1比m/z447.097 0少162 Da，为母核再失去1个葡萄糖所致；m/z257.027 5为木犀草素母核进一步失去CO的碎片离子所致，其裂解途径见图3。

3.4 其他成分分析 旋覆花内酯，分子式为C15H22O4，负离子模式下m/z265.146 1；二级碎片离子峰m/z221.157 7；碎片离子比母离子少44 Da，为母核失去1个CO2所致。大黄素，分子式为C15H10O5，负离子模式下m/z269.047 5；二级碎片离子峰m/z227.113 6、199.033 2，其中m/z227.113 6比m/z269.047 5少42 Da，为母核失去1个CO、1个CH2所致；m/z199.033 2比m/z227.113 6少28 Da，为进一步失去CO碎片离子所致，其裂解途径见图4。

3.5 抗补体活性研究 将效价及活性测试豚鼠血清(补体)用BBS 对倍稀释成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 后加到溶血体系中，发现在1∶2～1∶32 时溶血率接近100%，即基本达到全溶血，为确保体系能全部溶血，并提高药物筛选时方法的灵敏度，本实验选择1∶32，结果见表2。由此可知，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸CH50与阳性药(肝素钠)相近，强于香豆素、黄酮、蒽醌。

4 讨论

液质联用技术能够快速对复杂的化学成分体系进行分析[26-28]。本实验建立基于UHPLC-QTOF-MS/MS联用技术分析显脉旋覆花花序中的化学成分，并结合相关对照品和参考文献，共鉴定成分32种，其化学成分主要为黄酮和酚酸类成分，并含诸多其他类成分如香豆素、蒽醌及苷类等物质。酚酸类如咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸等，都具有抗炎、抗氧化的作用；黄酮类如槲皮素、木犀草素等，具有抗炎镇痛、抑菌等作用，这些成分都为显脉旋覆花花序在抗炎、抗氧化等作用提供较好的物质基础。此外，对鉴定的部分黄酮和酚酸类化合物进行了经典抗补体活性的测定，发现绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸等具有一定的抗补体活性，而特征性旋覆花内酯成分抗补体效果不强。本实验为显脉旋覆花花序的化学成分的研究及评价花序在增强免疫方面的功效提供一定的依据，并为后续显脉旋覆花花序质量评价及药理活性及其机制研究提供了详实的数据支撑，对未来显脉旋覆花花序进入食品资源目录的可能性奠定研究基础。

表2 各成分CH50测定结果