HPLC法同时测定参蒲盆炎颗粒中11种成分

于桂芳， 胡军华， 周 茆， 王星星， 吴 云， 王振中， 肖 伟

(江苏康缘药业股份有限公司，中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001)

参蒲盆炎颗粒由党参、大血藤等10味药材组成，具有益气活血、清利湿热、通络止痛之功效，用于气滞血瘀，湿热内阻型盆腔炎性疾病后遗症[1-2]。方中党参、大血藤、蒲公英、菝葜为君药，虎杖、皂角刺为臣药，其余为佐药，全方药味较多，成分复杂，但现有质量标准中的含量测定项仅有臣药、佐药中的2种成分，不利于对其工艺及产品进行全面评价；孙仙玲等[3]在现有质量标准基础上增加了延胡索乙素，并对指纹图谱进行了初步探索，但均未涉及参蒲盆炎颗粒多成分含量同时测定的方法。

对于中药复方制剂而言，各成分含量的综合测定可对其质量进行较为全面的评价[4-5]。本实验综合考虑参蒲盆炎颗粒中各药味活性成分与制剂的相关性，以及制剂实际情况，结合2020年版《中国药典》[6]及文献[7-22]，建立了HPLC法同时测定没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B的含量，可使方中君药、臣药、佐药均得到控制，而操作简便快速，对全面控制该制剂质量具有一定的参考意义。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配置DAD检测器(美国Agilent公司)；XP6型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BSA224S-CW型电子分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-250DB型数控超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试剂与药物 没食子酸(批号110831-201605，纯度90.8%)、丹参素钠(批号110855-201614，纯度98.1%)、原儿茶酸(批号110809-201205，纯度99.9%)、红景天苷(批号110818-201708，纯度98.8%)、原儿茶醛(批号110810-201608，纯度99.3%)、绿原酸(批号110753-201817，纯度96.8%)、芍药苷(批号110736-201842，纯度97.4%)、虎杖苷(批号111575-201603，纯度87.3%)、苯甲酸(批号100419-201703，纯度99.9%)、菊苣酸(批号111752-201703，纯度97.6%)、丹酚酸B(批号111562-201716，纯度94.1%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。参蒲盆炎颗粒(批号190701、200501、200502、200503，江苏康缘药业股份有限公司)。乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)；磷酸、甲醇等均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 分别精密称取没食子酸、丹参素钠、红景天苷、绿原酸、苯甲酸、菊苣酸对照品4、8、4、3、3、3 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇制成贮备液1；分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛对照品4、8 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇制成贮备液2。分别精密称取芍药苷、虎杖苷、丹酚酸B对照品4、3、3 mg，置于同一20 mL棕色量瓶中，分别精密加入上述2种贮备液2、1 mL，50%甲醇制成没食子酸、丹参素钠、红景天苷、绿原酸、苯甲酸、菊苣酸、原儿茶酸、原儿茶醛、芍药苷、虎杖苷、丹酚酸B质量浓度分别为40、80、40、30、30、30、8、15、200、150、150 μg/mL的溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备 取本品10袋，研细，分别取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液制备 按照处方工艺，分别制备缺相应药材的阴性样品，同时查阅文献[3]发现，大血藤、菝葜、蒲公英中均含有绿原酸，故还需制备同时缺该3味药材的阴性样品，按“2.2”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件 Waters Atlantis T3C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.15%磷酸(B)，梯度洗脱(0～15 min，5%～7%A；15～37 min，7%～21%A；37～47 min，21%～25%A；47～60 min，25%～36%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长230 nm(没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、芍药苷、苯甲酸、丹酚酸B)、325 nm(绿原酸、虎杖苷、菊苣酸)；进样量10 μL。

2.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中11个色谱峰与相邻峰均可达到基线分离；缺赤芍的阴性样品溶液在1号(没食子酸)、7号(芍药苷)、9号(苯甲酸)峰的相应位置未见色谱峰，表明三者主要来自赤芍，并且阴性无干扰；缺丹参的阴性样品溶液在2号(丹参素钠)、5号(原儿茶醛)、11号(丹酚酸B)峰相应位置未见色谱峰，表明三者主要来自丹参，并且阴性无干扰；缺大血藤的阴性样品溶液在3号(原儿茶酸)、4号(红景天苷)峰相应位置未见色谱峰，表明两者主要来自大血藤，并且阴性无干扰；缺虎杖的阴性样品溶液在8号(虎杖苷)峰相应位置未见色谱峰，表明该成分主要来自虎杖，并且阴性无干扰；缺蒲公英的阴性样品溶液在10号(菊苣酸)峰相应位置未见色谱峰，表明该成分主要来自蒲公英，并且阴性无干扰。前期报道，大血藤、菝葜、蒲公英中均含有绿原酸，并且本实验结果也显示缺各单味药的阴性样品溶液在6号(绿原酸)峰相应位置均可见色谱峰，而缺大血藤、菝葜、蒲公英的阴性样品溶液在相应位置未见色谱峰，表明该成分共同来自这3味药材，并且阴性无干扰。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密称取各对照品适量，按“2.1”项下方法制成每1 mL没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B质量浓度分别为390.53、709.56、82.33、366.15、124.55、247.68、1 484.47、1 007.62、244.32、237.08、1 026.54 μg的对照品溶液B7，逐级稀释，得到B6、B5、B4、B3、B2、B1。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL，在“2.4”项色谱条件下进样测定。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，并以信噪比S/N=10为定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.6.2 精密度试验 取对照品溶液B1、B4、B7及供试品溶液适量，在“2.4”项色谱条件下进样测定6次，测得对照品溶液中没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B峰面积RSD为0.07%～2.50%，供试品溶液中分别为0.32%、0.32%、7.39%、0.78%、1.44%、0.72%、1.84%、0.22%、0.38%、0.31%、0.31%，可知除原儿茶酸外均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取对照品溶液B4，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.54%、0.49%、0.82%、0.66%、0.59%、0.43%、0.34%、0.36%、0.42%、0.36%、0.24%，表明对照品溶液在24 h内稳定性良好。

取同一份供试品溶液，于0、3、6、9、12、18、24、27、33 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.23%、0.28%、6.84%、0.50%、1.39%、0.53%、1.65%、0.11%、0.52%、0.21%、0.23%，可知除原儿茶酸外均小于2%，表明供试品溶液在33 h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 取本品(批号190701)适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B含量RSD分别为0.36%、0.30%、5.88%、0.58%、1.17%、0.55%、1.64%、0.16%、0.46%、0.32%、0.36%，可知除原儿茶酸外均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的样品(批号190701)约0.5 g，精密称定，平行9份，每3份1组，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液(每1 mL分别含没食子酸、单参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B 0.518 6、0.917 7、0.093 4、0.522 6、0.161 5、0.347 6、2.132 0、1.769 0、0.359 1、0.374 8、1.526 4 mg)0.5、1.0、1.5 mL，加70%甲醇至25 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B平均加样回收率(RSD)分别为96.14%(1.65%)、103.45%(1.36%)、96.57%(6.92%)、94.02%(1.89%)、97.66%(2.39%)、99.21%(1.32%)、92.23%(1.97%)、98.57%(1.18%)、93.33%(1.12%)、97.09%(1.29%)、101.06%(1.80%)，可知除原儿茶酸外均小于3%。

2.7 样品含量测定 取本品4批(批号190701、20200501、20200502、20200503)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，结果见表2。由此可知，不同批次样品中没食子酸、原儿茶酸、丹参素钠、红景天苷、芍药苷、丹酚酸B含量差异较大，其原因可能为所用药材批间质量有明显不同。

表2 各成分含量测定结果(mg/g，n=4)

3 讨论

3.1 指标成分选择 本实验根据参蒲盆炎颗粒中每味药材的主要成分及药理作用，并结合制剂工艺特点及实际情况，最终确定红景天苷、原儿茶酸、绿原酸作为君药大血藤活性物质，绿原酸、菊苣酸作为君药蒲公英活性物质，虎杖苷作为臣药虎杖活性物质，没食子酸、芍药苷、苯甲酸作为佐药赤芍活性物质，丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛作为佐药丹参活性物质进行含量测定。

3.2 检测波长选择 本实验采用DAD检测器对对照品溶液进行全波长扫描，发现各成分最大吸收峰主要集中在230、270、325 nm处，其中230 nm处色谱峰信息量较大。综合考虑吸收值及检测方便，最终确定绿原酸、虎杖苷、菊苣酸检测波长为325 nm，其余成分为230 nm。

3.3 色谱柱选择 本实验考察了Kromasil、Phenomenex Luna、Waters Symmetry、Waters Atlantis T3C18色谱柱，考虑到参蒲盆炎颗粒药味多，成分复杂，流动相中水相的初始比例较高，最终确定为耐水的Waters Atlantis T3C18色谱柱，并发现其耐用性良好。

3.4 磷酸体积分数选择 本实验考察了0.05%～0.2%磷酸，发现其体积分数在0.12%～0.2%时各成分均达到理想的分离效果，最终确定为0.15%磷酸。

3.5 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了不同提取方式、提取时间、提取溶剂种类和用量，最终确定为25 mL 70%甲醇超声提取30 min，此时供试品溶液中各成分含量基本均达到最高，色谱峰峰形对称，并且操作方便。

4 结论

本实验建立了HPLC法同时测定参蒲盆炎颗粒中没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸、红景天苷、原儿茶醛、绿原酸、芍药苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B的含量，其中原儿茶酸可能由于处方药味较多，组成复杂，样品背景干扰大，含量较低，导致其精密度、重复性、回收率不理想，今后将作进一步优化，而其他成分上述指标均良好。该方法操作简便，可较全面地控制参蒲盆炎颗粒质量，具有一定实用价值，也能为今后相关开发利用提供借鉴。