基于GC-IMS技术的百香果果啤风味分析

龚 霄 陈廷慧 胡小军 范威威,3 李亚军 赵新强

(1. 岭南师范学院食品科学与工程学院，广东 湛江 524048; 2. 中国热带农业科学院农产品加工研究所农业农村部热带作物产品加工重点实验室，广东 湛江 524001; 3. 华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070; 4. 宁夏西班酒庄，宁夏 银川 751605)

果酿啤酒，又称为果啤，为精酿啤酒的一个重要品类，是在淡色啤酒酿造过程中添加果汁或可食性部分酿造而成的一种特殊啤酒[1]。果酿型啤酒既保留了啤酒自身的营养物质，如碳水化合物、氨基酸、维生素等，又融合了果汁中丰富的维生素、矿物质及生物活性物质等，无论是在风味上还是在口感上都较传统啤酒优越[2]。挥发性化合物是影响果啤风味的关键物质，主要包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类和烷烃等[3]，具有含量低、易挥发和不易萃取的特点[4-5]。气相色谱—离子迁移谱(GC-IMS)是近年来兴起的一项用于分析食品风味的新技术，将GC的高效分离优势与IMS的快速响应等特点相结合，能够有效提高检测的准确度[6]，具有操作简单、检测时间短、挥发性化合物损失少等优点，近几年被广泛应用于酒类分析中[7]。Yang等[8]利用该技术对不同果啤中的挥发性风味物质进行分析，筛选出不同果啤产品中的特征性风味化合物。但GC-IMS技术在百香果果啤风味分析中的应用还未见报道。

研究拟采用GC-IMS技术对百香果果啤酿造过程中的风味物质进行测定，结合多元统计分析初步确定百香果果啤中的关键风味物质，为百香果果啤的标准化生产和产品质量标准制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

皮尔森麦芽：威海德科生物科技有限公司；

青岛大花啤酒花：甘肃天马酒花股份有限公司；

西楚啤酒花：山东博朗生物科技有限公司；

艾尔啤酒酵母S-04、US-05、S-33：济南鲁丰啤酒有限公司；

啤酒酵母CS31和CN36：安琪酵母股份有限公司；

百香果原汁：糖度14.3 °Brix，pH 2.93，生产日期20210721，广西果朝食品有限公司；

C4～C9正构酮：98%，国药集团化学试剂有限公司；

4-甲基-2戊醇：98.5%，德国Dr. Ehrenstorfer公司。

现代工业经济不断提升，为我国的经济发展做出了重要的贡献，同时环保问题随之显现，成为了重大的环境污染源之一，所以，必须践行制造生产、环保优先的和谐发展理念［6］。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱—离子迁移谱：FlavourSpec®型，德国GAS公司；

MXT-WAX色谱柱：30 m×0.53 mm，1.0 μm，北京瑞斯特科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 GC-IMS分析 将百香果果啤样品轻轻打开，在酒体中部快速吸取2 mL并转移至20 mL顶空进样瓶中，半密封状态，4 ℃超声水浴(28 kHz)脱气30 s，1 g样品中加入内标4-甲基-2-戊醇10 μL。顶空进样体积100 μL；孵育时间10 min；孵育温度60 ℃；进样针温度65 ℃；孵化转速500 r/min；载气为高纯度氮气(≥99.999%)；清洗时间0.5 min。GC条件：柱温60 ℃；高纯度氮气(≥99.999%)；载气流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min内线性增至100 mL/min，10 min 内线性增至150 mL/min，运行时间20 min；IMS 条件：漂移管长度98 mm；管内线性电压500 V/cm；漂移管温度45 ℃；漂移气为高纯度氮气(≥ 99.999%)；漂移气流速150 mL/min；放射源为β射线(氚，3H)；正离子模式。

1.2.3 定性定量 通过比较GC-IMS图书馆搜索软件中标准的RI和漂移时间(DT)进行挥发性化合物的定性分析；采用4-甲基-2-戊醇为内标[9]，根据挥发性化合物的出峰面积与内标峰面积的比值，按式(1)计算其含量。

(1)

式中：

Ci——挥发性成分含量，μg/kg；

Ai——各物质峰面积；

Astd——内标物峰面积；

Cstd——内标物质量浓度，mg/mL；

Vstd——内标物体积，mL；

ρ——内标物密度，g/mL；

m——加入样品质量，g。

1.2.4 数据处理 采用Excel 2010和SPSS 16.0软件进行数据分析，每组样品重复3次，结果以平均数±标准偏差表示(P<0.05)。通过Simca 14.1对香气物质进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。

2 结果与分析

2.1 百香果果啤酿造阶段挥发性物质分析

由图1和表1可知，不同酿造阶段的百香果果啤中共鉴定出63种挥发性有机物(同一化合物单体与二聚体视为一种)，其中酯类26种，醇类10种，醛类9种，酸类2种，酮类7种，烷烃类6种，呋喃类2种和醚类1种。挥发性酯对啤酒风味的影响最为显著，其组成、气味阈值和相互作用对酒体整体的风味感知具有重要影响[10]。除(Z)-3-己烯基己酸酯和癸酸乙酯外，麦汁中其他酯类含量均低于其他酿造阶段。酯类物质大都在发酵过程中产生，且百香果果汁的添加可以促进酯的积累。己酸乙酯(甜香、香蕉、青苹果香味)、乙酸异戊酯(香蕉、梨、苹果香味)、丁酸乙酯(香蕉、菠萝、草莓香味)、乙酸异丁酯(花香)、丙酸乙酯(苹果香味)、乙酸乙酯(菠萝香味)和乙酸丙酯(梨香味)等在百香果果啤中含量较为丰富。

挥发性酸是造成pH值变化的主要因素，并呈现出典型的醋味和过熟水果味[11]。百香果果啤中测定出两种主要挥发酸(乙酸和丙酸)，发酵过程中乙酸质量分数显著增加，在初始麦汁中含量为(404.14±21.03) μg/kg，发酵前期含量增加至(1 218.14±62.81) μg/kg，约是麦汁中的3倍。

图1 百香果果啤酿造过程中香气物质热图Figure 1 Heat map of flavor substances in passion beer during the brewing process

成品酒贮藏1个月后乙酸质量分数[(1 186.96±75.60) μg/kg]较成品酒的[(1 354.57±16.82) μg/kg]显著下降。丙酸是麦汁中糖降解的产物，在啤酒发酵过程中间接影响乙醇的生成，同时也为酯的合成提供前体，在贮藏过程中快速上升，约是贮藏前[(241.00±14.98) μg/kg]的13倍。

乙醇是酒精发酵过程中的代谢产物，果汁的添加会提高可发酵糖含量，随之产生的乙醇量就会增加。乙醇对最终果啤中的风味有较大影响，当乙醇未很好地平衡时，会产生强烈的刺激性气味和杂醇味[12]。麦汁中甲醇[(1 288.19±28.68) μg/kg]质量分数最高，可能和糖化酶的使用有关。但在酵母发酵过程中，甲醇质量分数逐渐下降到(231.99±15.67) μg/kg，低于啤酒中限量标准(50 mg/kg)。1-己醇[(506.39±8.71) μg/kg]、1-戊醇[(147.88±2.37) μg/kg]、正丁醇[(203.07±2.30) μg/kg]、异戊醇[(1 380.51±14.48) μg/kg]和2-甲基丙醇[(528.19±9.67) μg/kg]在成品酒中的质量分数显著增加(P<0.05)。整个酿造过程中，(Z)-3-己烯-1-醇和1-戊醇质量分数较低，与酵母代谢相关性较弱有关。异戊醇和2-甲基-1-丙醇与啤酒的可饮性密切相关，除乙醇外，异戊醇在啤酒中质量分数最高，其次是2-甲基-1-丙醇。

醛类物质是酒精发酵过程中的中间代谢物，主要来源于Strecker降解或酵母代谢副产物，与啤酒老化有关[13]。当啤酒中某些醛类化合物含量超过气味阈值时，通常会呈现出强烈的未成熟、硬纸板和腐烂的香气。百香果果啤发酵中期丙醛(氧化苹果味)、正丁醛(香瓜、绿麦芽味)、3-甲基-2-丁烯醛(杏仁香味)和戊醛(青草、苹果、奶酪味)显著增加。

2.2 主成分分析

由图2可知，同一平行样品聚类良好，但与其他样品组被很好地区分，说明百香果果啤中挥发性物质的组成在酿造过程中发生了显著变化。PC1和PC2贡献率分别为62.1%和19.1%，累计贡献率为81.2%，表明其可以代表百香果果啤中整体的风味组成。在PC1方向上，麦汁与其他发酵阶段能够很好地区分开来，说明PC1与麦汁发酵前后引起的挥发性代谢产物的变化密切相关，主要的化合物有2-甲基丁酸丁酯(果香)、丁酸乙酯(香蕉、菠萝、草莓香味)、丙酸乙酯(苹果香味)、1-戊醇(柑橘、柠檬香味)和γ-萜品烯(柠檬香味)等，其多是在酵母参与发酵后产生的；在PC2方向上，发酵前期、中期、成品酒与后贮果啤产品有效区分开，表明PC2与果啤发酵过程引起的挥发性代谢物变化密切相关，主要的化合物有乙酸甲酯(溶剂、果香味)、异丁酸乙酯(苹果、柑橘、菠萝香味)、2-甲基丙醛(果香、香蕉、甜瓜香味)、戊醛(坚果气味)、丙酸(酸腐，酱油味)和2-戊酮(茉莉、天竺葵香味)等。2-甲基丙醛、丙酸和2-戊酮含量在后贮过程中显著增加，其中，2-甲基丙醛被认为是啤酒老化的标志物[14]。

图2 百香果果啤酿造过程中风味物质主成分分析Figure 2 Principal component analysis of flavor substances during the brewing of passion beer

2.3 正交偏最小二乘法判别分析

由图3可知，麦汁风味与2-甲基丁酸丁酯-D、甲醇、3-羟基丁酮的相关性较强；发酵前期风味与乙酸丁酯-M、3-甲基丁酸乙酯、甲酸乙酯、正丙醇、苯甲醛、乙醇、柠檬烯和乙酸甲酯-M具有较强的相关性；发酵中期风味与丁酸丁酯-M、乙酸异戊酯-M、正丁醇-M、3-甲基-1-丁醇-D、2-甲基丙醇-D、乙酸-M和1-戊烯-3-酮具有较强的相关性；成品酒风味与乙酸异戊酯-D、乙酸异丁酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、1-戊醇、4-甲基-3-戊烯-2-酮和莰烯-M具有较强的相关性；后贮酒风味与丁酸己酯-M、乙酸丁酯-D、4-萜烯醇、1-己醇-M、丙酸和2-辛酮-M的相关性较强。

为了避免小样本量带来的误差，对200个样本进行随机排列测试，以验证模型的稳定性。Q2和R2的截距分别为-0.716和0.321，表明该模型未出现过度拟合现象，具有统计学意义[15]。在代谢组学中，VIP值通常被用来评估X变量对OPLS-DA模型的贡献率，VIP值>1通常被认为是关键变量。在OPLS-DA模型中共有30种化合物的VIP值>1，依次为四氢呋喃-D、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙醛、丙酸、二甲硫醚、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、四氢呋喃-M、丁酸乙酯-D、丙醛-D、正丙醇、戊醛、甲酸乙酯、乙醇、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯-M、乙酸异戊酯-D、2-甲基丙醇-D、丙酸乙酯、1-戊烯-3-酮、1-戊醇、乙酸-M、甲醇、2-丁基呋喃、乙酸甲酯-D、乙酸甲酯-M、丁酸乙酯-M、丁酸己酯-M和异戊醇-D。

六边形代表不同的样品，3个相近六边形为同一酒样的平行处理，圆点代表挥发性化合物

2.4 相对气味活度值计算

为进一步探究各化合物对果啤香气成分的贡献，对检测到的化合物ROAV值进行计算。由表1可知，麦汁的关键香气物质为4-萜烯醇、苯甲醛、乙酸己酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、丙酮、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、二甲硫醚、异丁酸乙酯和乙酸香茅酯等；发酵前期关键香气物质为4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、丙酮、正丙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚和异丁酸乙酯等；发酵中期关键香气物质4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸己酯、丙酮、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、1-戊烯-3-酮、异丁酸乙酯和乙酸香茅酯等；成品酒中关键香气物质为4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸异丁酯、丙酮、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、异丁酸乙酯、乙酸香茅酯、戊醛和正丁醛等；后贮酒关键风味物质为丙酸、4-萜烯醇、苯甲醛、丁酸己酯、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸异丁酯、丙酮、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、异丁酸乙酯、乙酸香茅酯和戊醛等。

表1 基于GC-IMS的百香果果啤酿造过程中的风味物质及其含量†

续表1

续表1

将ROAV与VIP值结合，两者均≥1的物质有丁酸己酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸异丁酯、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯和二甲硫醚，共9种。以酯类化合物居多，是果啤香气的主要贡献者，如乙酸己酯(苹果、樱桃)、乙酸异戊酯(香蕉香味)、丁酸乙酯(香蕉、菠萝香味)、乙酸异丁酯(花香)、3-甲基丁酸乙酯(苹果香味)和乙酸丙酯(特殊的水果香气)。

3 结论

采用GC-IMS技术分析了百香果果啤酿造过程中的风味物质变化，共鉴定出63种风味化合物，其中酯类26种，醇类10种，醛9种，有机酸类2种，酮类7种，烷烃类6种，呋喃类2种，醚类1种。百香果果啤发酵过程中，酯类物质主要是通过酰基化、缩合和酯化等生化反应生成；醇类物质主要是酵母代谢的副产物；醛酮类物质主要与Strecker降解、美拉德反应和氧化有关，此外，还与醇的氧化、酮酸脱羧、氨基酸脱氨及脱羧反应有关。主成分分析结果表明，PC1和PC2累计差异贡献率为81.2%，说明百香果果啤酿造过程中风味物质发生显著变化。采用正交偏最小二乘判别分析(VIP值>1)、结合相对气味活度值(ROAV值≥1)，初步确定百香果果啤酿造过程中的15种潜在的关键风味物质，包括丙酸、丁酸己酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸异丁酯、3-甲基丁醛、异戊醇、2-甲基丙醇、正丙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、3-甲基-2-丁烯醛和戊醛。鉴于试验条件的限制，尚未进行百香果果啤的中试生产放大试验。因此，生产工艺的稳定性和产品质量的一致性还有待深入研究。