海绵动物共附生石油烃降解菌的筛选、复配及其降烃影响因素响应面优化

侯亚楠, 刘书伟, 王 燕, 张田田, 王阿文, 沈梦霞

(海南热带海洋学院 生态环境学院, 海南 三亚 572022)

0 引言

石油被誉为工业的血液，它不仅是社会发展的重要能源，也是许多化工产品的原料[1].近年来，在石油开采、炼制和运输等过程中，溢油事故频发[2]，释放到海洋环境中的石油烃化合物影响海洋生态系统，进而威胁人类健康[3].消除石油污染和保护海洋环境已经成为全世界关注的环境问题[4].目前，海洋石油烃污染的处理方法主要有物理法、化学法和生物法[5]，但物理法处理不彻底，化学法易造成海洋环境二次污染，生物法具有降油效果好、成本低和二次污染小等优点，因此，生物法已成为最具有应用前景的石油烃污染的修复技术[6].然而，海洋溢油事件发生后，常采用围油栏、撇油器收集海面上大量的石油烃，对于已扩散或残留的石油烃，暂无有效的处理方法，进一步分散到海水中，致使这类石油烃污染物的集中处理成为一个难题.

海绵是一种多细胞滤食性海洋动物，具有较强的泵水能力，每天泵水量可达自身的体积的170～72 000倍，加勒比海的海水几乎每天都被海绵过滤一遍[7].海绵动物独特的孔状结构使其成为许多海洋微生物的优良宿主[8]，其滤食性使微生物在海绵体内不断积累，并与之形成共生体，所以海绵动物体内含有大量微生物，许多种类其体内微生物的比重高达40%～60%[9].海绵-微生物共生体类似于布满微生物的筛子——“微生物筛”，其利用海绵动物不断泵水的特征，将海水源源不断地泵入“微生物筛”，海水中的污染物在通过“微生物筛”时，有一部分被微生物降解，所以，海绵-微生物共生体对海水具有一定的净化能力[10].可见，从海绵中分离具有降解功能的微生物，用于海洋环境的生物修复具有非常重要的意义.

本研究从海绵动物中筛选降烃菌株，并对其进行鉴定、复配和响应面优化实验，探讨和分析不同温度、pH值、转速和石油烃浓度等环境因素对目标菌株降烃效果的影响，以期构建具有良好降烃效果的海绵-降烃菌株共生体，从而解决海洋石油烃污染物难以集中处理的问题.

1 实验部分

1.1 试验材料

1.1.1 主要材料

海绵动物样品取自海南省黎族自治县清水湾；实验所用石油烃由中国海洋石油集团有限公司提供，密度为0.92 g/mL.

1.1.2 主要试剂

氯化钠(AR)、磷酸氢二钠(AR)、氯化铵(AR)、硫酸镁(AR)和硝酸钾(AR)等试剂购自天津市福晨化学试剂厂，石油醚(AR)购自西陇科学股份有限公司，D2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix购自天根生物科技有限公司.

1.2 主要仪器设备

DGL-35B高压灭菌锅(上海力辰邦西仪器科技有限公司)、UV-5100紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)、Flexcycler多功能PCR仪(德国耶拿分析仪器股份公司)、Enduro GDS凝胶成像系统(深圳市赛进生物科技有限公司)等.

1.3 试验方法

1.3.1 石油烃降解菌的富集、分离和纯化

将海绵剪碎后置于无菌研钵中，并加入适量无菌海水，充分研磨后取上清液5 mL于100 mL石油烃培养基[11]中，在28 ℃、160 r/min条件下富集7 d，当培养基中出现浑浊现象，取5 mL培养液转入100 mL新鲜的石油烃培养基中，连续富集3次后，对降烃菌进行稀释涂布和纯化[12].

1.3.2 石油烃降解率的测定

采用紫外分光光度法[13]绘制石油烃标准曲线，以石油烃浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程为y=0.005 5x-0.005 9，R2=0.999 1；石油烃降解率计算公式[14]如式(1)所示：

(1)

1.3.3 菌株的鉴定

以降解率为指标，优选降烃效果最佳的3株单菌株进行鉴定，如果3株单菌株种属相同，则鉴定降烃效果次之的单菌株，以此类推，直至选出降烃效果最佳的3种菌株.鉴定方法采用16S rDNA测序，即：将菌株培养至对数期，离心并提取总DNA，以总DNA为模板，采用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行PCR扩增，取5 μL PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳20 min，送至上海生工生物公司进行测序.测序结果运用Genbank中的BLAST进行序列比对，鉴定菌株的种属，并采用MEGA7.0软件建立发育树.

1.3.4 石油降解复合菌系的构建

对优选的3种菌株采用2种菌种或3种菌种复配，共计4个组合.组合内各菌株量比例相等，每个组合菌株总浓度相等(用无菌生理盐水调节对数生长期的菌株浓度为OD600=1.5)，从每个组合中取体积1 mL的菌液分别加入4个50 mL石油烃培养基中，并设置空白对照(无菌的50 mL石油烃培养基)，30 ℃、160 r/min培养7 d.测量各培养基中石油的含量，计算降解率，选择降解率最高的一组作为优势菌群进行下一步试验.本实验设置三个重复.

1.3.5 单因素试验

参考吴秉奇等[15]的方法并改良设定单因素试验的培养条件：(1)培养温度：20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃；(2)培养基初始pH值：5.6、6.4、7.2、8.0和8.8；(3)摇床转速：120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min和200 r/min；(4)石油烃初始浓度：10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L.石油烃降解率的测定方法同1.2.2.本实验设置三个重复.

1.3.6 响应面优化条件、模型拟合与验证

根据单因素试验结果，选取对降解率影响较大的3个因素为自变量，以石油烃降解率为响应值，设计3因素3水平响应面试验，对所得结果进行二次回归拟合及方差分析检验，得出各变量最佳参数.按照模型最佳参数进行验证实验，检验模型的可靠性，分析最终优化结果.本实验设置三个重复.

1.3.7 数据统计

利用SPSS19.0软件对试验数据进行统计分析，采用单因素方差分析法进行显著性检验，并选用Origin5.0进行作图，利用Design Expert 8.0软件对响应面实验结果进行分析，并提出回归模型.

2 结果与讨论

2.1 降烃菌株的筛选、鉴定和复配

2.1.1 降烃菌株的筛选

经过稀释涂布法初步分离，筛选降烃菌株23株(图1)，分别命名为Y1、Y2、Y3……Y23.根据标准曲线测定菌株的降解率，其中降解率超过20%的微生物有7株，降解率超过30%的微生物有3株为Y2、Y5和Y6，其降解率分别是30.09%、33.90%、30.45%，优选降烃效果最佳的3株单菌株开展后续鉴定实验.如果3株单菌株种属相同，则鉴定降烃效果次之的单菌株，以此类推，直至选出降烃效果最佳的3种菌株.

图1 单菌株对石油烃的降解能力

2.1.2 降烃菌株的鉴定

对菌株Y2、Y5和Y6进行16S rDNA基因扩增与测序，并将所得序列进行BLAST比对，利用MEGA7.0软件的N-J法建立系统发育树，如图2所示.从系统发育树上可以看出，菌株Y2与Stappia属菌株Stappiaconradaestrain MIO处于一个最小的独立分支，且自展支持率为99，并与该属其他物种处于相近却又不同的分支，由此可以鉴定菌株Y2为Stappia属的菌株，并且为Stappiaconradae物种.同理分析可得，菌株Y5为Halomonas属的菌株，并且为Halomonasaquamarina物种；菌株Y6为Sphingopyxis属的菌株，并且为Sphingopyxisterrae物种.

图2 菌株Y2(NR115950.1)、Y5(EU440965.1)和Y6(MH385010.1)的16S rDNA系统发育树

2.1.3 降烃菌株的复配

对Y2、Y5和Y6开展复配实验，其结果如表1所示.由表1可知，复合菌系Y5-Y6对石油烃的降解率最高，因此，选取复配菌群Y5-Y6进行后续的降解条件优化实验.由于石油成分复杂，单一菌株难以完成对石油全组分的降解，通过不同菌株间的共生和协同作用形成复杂的微生物区系，可以实现污染物的有效降解，进而提高石油降解率[16].宁卓等[17]研究发现石油降解菌组合的降解率或高于或低于单菌株的降解率，这是由于微生物之间存在各种相互关系，如共附生、竞争和拮抗等.本研究中也观察到了类似的结果，Y2-Y5-Y6组合的降解率低于Y5-Y6组合，可能是由于微生物之间存在拮抗关系.细菌组合的选定仅靠“降解率”单一指标来进行，各种微生物之间的相互作用以及降解机理有待进一步研究.

表1 石油混合菌群复配方案及结果

2.2 单因素试验

2.2.1 初始pH值对降解率的影响

酸碱环境是微生物生长代谢的主要影响因素之一，环境pH值过高或过低都会影响微生物酶的活性，从而影响菌株对石油烃的降解.由图3可知，石油烃降解率随着pH值的升高呈现先上升后下降的趋势，其中pH=8.0时降解率达到峰值(39.90%).

图3 初始pH值对石油烃的降解率影响

2.2.2 石油烃浓度对降解率的影响

图4显示了降解率随石油烃浓度呈先升高后降低趋势，当石油烃浓度为20 g/L降解率达到峰值；石油烃浓度从20 g/L升至50 g/L，降解率急剧下降，同时石油烃的实际降解量也随之降低，说明高浓度的石油烃,抑制了微生物的活性,影响了菌体生长，也会导致溶解氧含量的降低，影响微生物的代谢作用.

图4 石油烃浓度对降解率影响

2.2.3 转速对降解率的影响

由图5可知，随着转动速度由120 r/min提高至160 r/min，组合Y5-Y6的降烃效果逐渐升高，当转速为160 r/min时，石油烃的降解率随着溶解氧的升高而变大；当转速继续上升至200 r/min时，降解效果反倒有所下降，可能是由于振速过高影响细菌与碳源的接触情况.

图5 转速对石油烃的降解率影响

2.2.4 温度对降解率的影响

温度会影响微生物自身的代谢活性[18].由图6可知，组合Y5-Y6降烃的最佳温度是30 ℃，石油烃的去除率达40%以上.当温度低于或高于30 ℃时，酶的活性可能降低，导致该组合的降解率变小.

图6 温度对石油烃的降解率影响

2.3 响应面结果分析

2.3.1 响应面法实验方案与结果

利用SPSS对单因素试验结果进行分析，选取对降解率影响较大的3个因素初始pH值、温度和石油烃浓度为自变量，各因子和水平情况见表2所示.依据Box-Behnken 设计原理进行了17次试验，其结果见表3所示.

表2 各因子和水平

表3 响应面试验方案及结果

2.3.2 回归方程与方差分析

采用Design Expert 10软件对响应面实验结果进行回归拟合，得出降解率对三个因素的多元二次回归模型：Y=51.22+4.17A+1.71B-6.26C+2.63AB+0.018AC-0.88BC-14.99A2-10.56B2-11.11C2.表4显示，其失拟项P值为0.721 0>0.05，说明该模型建立合理.模型的相关系数R2=0.996 7，表明石油烃降解率的实际值与预测值之间拟合度较好，模型的调整决定系数R2adj=0.992 5，说明有99.25% 的石油烃降解条件可以用该模型进行分析解释.

表4 回归模型方差分析

2.3.3 响应面曲线图和等高线图分析

响应曲面的坡度及等高线的偏离程度可反映两两因素间的交互作用，响应面坡度越陡，表明二者间的交互作用越显著，对石油烃降解率影响较大，反之越平缓则影响越小[19].由图7～9可知，3个因素对石油烃降解率的影响为：C>A>B；在交互项对石油烃降解率的影响中，A与B交互作用显著，A与C、B与C交互作用不显著.这与回归方程模型的方差分析结果一致.

图7 pH值与温度交互影响石油降解率的响应面

图8 初始pH值与石油浓度交互影响石油烃降解率的响应面

图9 温度与石油浓度交互影响石油烃降解率的响应面

2.3.4 最佳降解工艺及验证实验

利用Design Expert软件对模型方程求解，预测最优条件初始pH值、温度、石油烃浓度相应值为8.12、30.55 ℃、17.14 g/L时，其响应值降解率最大为52.52%.根据实际情况，将浓度和温度分别修改为17 g/L、30.5 ℃，其它条件不变.在此工艺下进行验证性试验，重复3次，得到降解率平均值为50.73%，与模型预测值52.52%吻合度较高，表明该模型可以较好地预测实际情况.

3 结论

(1)本研究从海绵动物中筛选出23株石油烃降解菌，其中有3株细菌石油烃降解率较高，对其进行鉴定得出Y2为Stappiaconradae、Y5为Halomonasaquamarina、Y6为Sphingopyxisterrae.根据菌株复配后组合的降解率可得知，由Y5和Y6组成的菌群组合降解率最高，7 d后，石油烃降解率达到39.05%.

(2)本试验在单因素试验的基础上，通过Box-Bchnken响应面法，对石油烃降解率的影响条件进行了优化，发现对降解率的影响较大的3个因素依次石油浓度>初始pH值>温度；建立了回归模型，该模型预测得到最优条件初始pH值、温度、石油烃浓度相应值为8.12、30.55 ℃、17.14 g/L时，其响应值降解率最大为52.52%，验证试验的石油烃降解率为50.73%.实测值和模型预测值相近，表明该模型可以较好地预测实际情况.