肺腺癌细胞与血小板共孵育促进HUVEC促凝表型形成

朱婷 董星宇 陈诗雨 吴晓红 叶明君 李白坤 李庆林

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，肺腺癌则是较为多见的肺癌类型[1]。研究显示，高凝状态及其所致的血栓栓塞是影响肺癌病人治疗效果的重要因素[2]；因为血液高凝状态不但可增强循环癌细胞的存活力，还会增强循环癌细胞向血管内皮细胞(VEC)的黏附力，为癌细胞进一步实现跨内皮迁移提供便利[3]。导致癌症患者血液高凝状态的原因复杂，进入血管的癌细胞可通过活化血小板和(或)血管内皮细胞等，促进高凝状态形成[4]。同时，活化血小板又可将癌细胞包裹起来增强其存活力，并介导癌细胞向VEC黏附等[5]。因此，肺腺癌细胞与血小板共孵育后，可能会增加VEC损伤和促凝表型形成，但相关研究却非常鲜见。本文采用共培养体系模拟体内微环境，观察肺腺癌细胞H1299与血小板串扰对VEC促凝表型形成的作用。

资料与方法

一、 材料和试剂

人肺腺癌细胞株(H1299)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)均来自安徽中医药大学科研技术中心。β-actin(Abbkine)，细胞间黏附分子(ICAM-1)(absin), 血管细胞黏附分子(VCAM-1)(Affinity)，P-选择素受体(PSGL-1)(Bioss)。山羊抗兔IgG(absin)，山羊抗鼠IgG(absin)，1640培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(维森特生物技术有限公司)，双抗、胰酶(碧云天)，CGS缓冲液(氯化钠3.6g、D-葡萄糖3.3g、柠檬酸钠2.165g，试剂溶解于95mL超纯水，调节PH至6.5，定容至500mL，现配现用，0.22um滤头过滤，37℃水浴预热)。

二、 实验方法

本研究获得安徽省中医院伦理委员会批准(2020AHZY-01)。

1 细胞培养

HUVEC和H1299细胞复苏后，置于含10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基中，37℃、5%CO2环境下培养，取状态良好的细胞进行实验。

2 洗涤血小板制备

取健康成年志愿者静脉全血10mL，枸橼酸抗凝，200g离心20min后，吸出富血小板血浆，800g离心10min后，弃上清，以预热过滤后的CGS重悬PLT沉淀，600g离心5min，洗涤3次后，以预热的无血清培养基重悬血小板，将浓度调至3.0×108个/mL后进行实验研究。

3 条件培养基制备

H1299条件培养基(CM_H)制备：H1299细胞长至70%～80%密度时，更换含1%胎牛血清的1640培养基，继续培养24h后，取上清，3000r/min离心10min，0.22um微孔过滤后，-20℃保存备用。H1299和血小板共培养条件培养基制备(CM_HP)：H1299细胞长至70%～80%密度时，更换含1%胎牛血清的1640培养基，同时加入洗涤血小板(血小板：瘤细胞=200)，继续培养24h，取上清，3000r/min离心10min，0.22um微孔过滤后，-20℃保存备用。

4 鬼笔环肽染色

取状态良好的HUVEC接种于24孔板爬片，加入不同种类条件培养基孵育24h后，取出24孔板，PBS洗3遍，每次5min，多聚甲醛固定20min，PBS洗3遍，每次5min， 0.1%曲拉通透化5min，PBS洗3遍，每次5min，每孔加入FITC-鬼笔环肽染色液200 uL，室温避光染色20min，弃染色液，PBS洗3遍，每次5min，DAPI染色10min，PBS洗3遍，每次5min，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

5 酶联免疫吸附测定

将CM_H、CM_HP和PLT分别作用于HUVEC，24h后收集上清，按照ELISA试剂盒说明书配置标准品，测定上清中的PS含量，450nm处测定OD值，根据标准曲线计算不同上清中的PS水平。

6 蛋白免疫印迹法

收集处理过的各组细胞，冰上裂解，提取细胞中总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，与Loading buffer混合，100℃，10 min煮沸，进行SDS凝胶电泳，200mA，转膜2h，用5%脱脂奶粉室温封闭2h，放入一抗，4℃条件下过夜，次日取出，与山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG室温孵育2h，TBST漂洗后，曝光，以β-Actin为内参分析蛋白表达水平。

三、 统计学方法

结 果

一、 H1299和血小板共培养促进HUVEC骨架改变

细胞骨架是调控细胞运动的重要因素，鬼笔环肽染色后采用激光共聚焦显微镜可观察细胞骨架的改变情况。研究结果显示，HUVEC组细胞骨架排列清晰，呈丝网状；HUVEC+CM_H组边缘不光滑，细胞骨架排列不清晰；HUVEC+CM_HP组细胞骨架排列不清晰，微丝部分缺失，出现丝状伪足，HUVEC+PLT 组，HUVEC边缘光滑，微丝有所减少，细胞形态有所变化(见图1)。

图1 鬼笔环肽染色的HUVEC细胞骨架(激光共聚焦显微镜，×100)

二、H1299和血小板共培养促进HUVEC上清PS的表达

由(图2)可见，4组的PS表达水平差异有统计学意义(F=31.17，P<0.001)；且HUVEC+CM_HP组(2.66±0.06)的表达量高于HUVEC组(2.15±0.04)、HUVEC+CM_H组(2.26±0.07)和HUVEC+PLT组(2.34±0.05)，HUVEC+PLT组PS表达量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 HUVECPS的表达水平

三、H1299和血小板共培养促进HUVEC ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1的表达

ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1在HUVEC处于静息状态时低表达，与肺腺癌细胞和血小板共存时高表达。由(图3)可见，CM_HP可促进HUVEC上述三种蛋白的表达，且各组间蛋白的表达差异均有统计学意义(ICAM-1：F=142.60，PSGL-1：F=56.53，VCAM-1：F=147.90，P<0.001)。进一步分析发现，HUVEC+CM_HP组ICAM-1表达量(2.57±0.11)高于HUVEC(1.00±0.03)、HUVEC+CM_H(1.23±0.08)和HUVEC+PLT组(1.40±0.09)；HUVEC+CM_H和HUVEC+PLT组ICAM-1表达量均高于HUVEC组(P<0.001)。类似的，HUVEC+CM_HP组的PSGL-1(1.98±0.13)表达量高于HUVEC(1.00±0.02)、HUVEC+CM_H(1.26±0.07)和HUVEC+PLT组(1.34±0.04)；HUVEC+CM_HP组的VCAM-1(2.93±0.12)表达量也高于HUVEC(1.00±0.03)、HUVEC+CM_H组(1.12±0.05)和HUVEC+PLT组(1.17±0.16)(P<0.001)。提示，肺腺癌细胞和血小板共孵育，可能促进了内皮细胞黏附分子的表达，有利于内皮细胞促凝表型形成。

图3 H1299和血小板共孵育上调的ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1 蛋白表达量

讨 论

转移是导致肺腺癌治疗失败的主要原因之一[6]，探究影响肺癌发生转移的因素，有利于针对性地进行干预。研究表明，内皮细胞促凝表型的形成可能与PS外翻有关[7]，促凝表型的主要特征是细胞骨架改变，并伴随ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1等黏附分子表达量增加等[5]。研究发现，肿瘤细胞和血小板自身，都具有一定的促进内皮细胞黏附蛋白表达的作用[8]。考虑到肺腺癌细胞可活化血小板，活化并结合内皮细胞，血小板对肺癌的转移具有重要作用[9]，血小板可促进肺癌细胞的活力与增殖，促进肿瘤生长[10]；因此，肺腺癌细胞与血小板共培养，可能促进内皮细胞形成促凝表型[11]。

本研究结果显示，与H1299和血小板共孵育后，内皮细胞骨架发生改变、上清中PS的表达量以及内皮细胞中的几种黏附分子表达量均显著增加；而单独与肺腺癌细胞或血小板共孵育的内皮细胞骨架改变情况、PS和黏附分子表达也较单纯内皮细胞组增加，但程度明显低于H1299和血小板共孵育组。提示，与H1299细胞和血小板共培养可能通过某种途径，促进了内皮细胞结构的改变和相关分子的表达，进而诱发HUVEC促凝表型形成；研究结果同Chuang P.C.以及Falanga A.的研究结果相似[5,12]。但也有研究提示活化的血小板可通过保护内皮细胞免受肿瘤细胞的渗透而抑制肿瘤转移[8]。出现这种不一致现象的原因目前尚不完全清楚，可能与细胞株和实验条件等不同有关[13]。

综上所述，本研究发现与H1299细胞和血小板共培养可能为内皮细胞促凝表型的形成提供了便利，抑制肿瘤细胞-血小板-血管内皮细胞间的相互作用，可能有助于改善肺腺癌的高凝状态，抑制肿瘤细胞跨内皮迁移的实现，进而降低肿瘤转移风险。诚然，本研究结果还有待进一步开展动物实验和临床试验去深入探究。