DLL3表达和血清NSE与小细胞肺癌预后的相关性分析

2022-12-01刘丹丹张孝飞王锦黄慧华程雪松

临床肺科杂志 2022年12期

刘丹丹张孝飞王锦黄慧华程雪松

小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)是神经内分泌细胞来源的肺恶性肿瘤，占每年全球肺癌新发病例的15%～20%[1-2]。SCLC恶性程度在所有类型肺癌中最高。目前晚期小细胞肺癌的主要治疗方法包含放疗和化疗[3- 4]。免疫治疗仅能使少数患者获益[5]。DLL3基因别名SCDO1，有研究表明，DLL3基因突变可能导致骨骼发育异常[6-7]，且在SCLC肿瘤组织及非肿瘤组织中具有差异表达的特征[8-10]，DLL3可促进SCLC的增殖、侵袭[11]，但目前关于DLL3在SCLC预后中的价值存在争议[12]。神经元特异性烯醇化酶(Neuron- specifc enolase,NSE)被认为是诊断恶性肿瘤的生物标志物[12]。研究证实，NSE在SCLC患者细胞中高表达通常提示预后不佳[13-14]。但是，血清NSE水平可能由于其检测方法和抗体不同而有所不同[15]。部分非肿瘤性疾病也可引起血清NSE水平升高，例如颅脑损伤[16]，因此其缺乏特异性。本研究旨在研究DLL3在组织中的表达联合血清NSE水平对评估SCLC患者预后中的价值。

资料与方法

一、一般资料

筛选自2017年1月至2020年12月在安徽省第二人民医院和亳州市人民医院首次诊断为SCLC且未治疗的97例患者，其中男性83例，女性14例，依据国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC) 2017肺癌TNM分期将上述患者分为Ⅲ期35例，Ⅳ期62例，具体临床特征(见表1)。所有标本均来源于气管镜或经皮肺穿刺标本。纳入标准：(1)年龄 ≥ 18岁；(2)肺部具有可评估的病灶；(3)ECOG评分0～1分；(4)存活时间 ≥ 2个月；排除标准：(1)合并严重的心脑血管疾病、血液系统疾病和肝肾功能不全；(2)合并其他系统原发肿瘤或者复发转移性肿瘤；在手术或任何其他治疗之前，采用ELISA法测量NSE的血清浓度， Meta分析结果[17]指出NSE临界值范围为7.5 ng/mL至35 ng/mL，因此本实验选择的临界值为35ng/mL。该研究已通过两家医院伦理委员会批准，[(L)2021-001]。

二、实验方法

采用免疫组化的方式检测DLL3在SCLC组织中的表达情况。简要步骤：石蜡包埋组织切片脱蜡水化，柠檬酸钠抗原修复液修复20min，3%H2O2孵育10min阻断内源性过氧化物酶活性，PBS缓冲液冲洗，DLL3单克隆抗体(E3J5R，购自美国Abcam公司)按1:100稀释后，置于4℃环境中过夜，生物素标记的二抗37℃孵育15min，37℃SABC孵育15min，DAB染色，苏木素再次染色，酒精脱水，中性树胶封片。用半定量分析计数系统，采用免疫组织化学染色结果，根据染色强度(staining intensity, SI)和阳性细胞百分率(percentage of positive cells, PPC)综合计分进行结果判定。其中染色强度分为以下几种：无染色-0分、弱染色-1分、中等染色-2分、强染色-3分，阳性细胞的百分率：无阳性细胞-0分、<10%阳性细胞-1分、 10%～50%阳性细胞-2分、≥50%～80%阳性细胞-3分、≥80%阳性细胞-4分，将染色强度和阳性细胞百分率乘积总分(immuno-reactive sum score, IRS)进行分组，即IRS=SI×PPC，IRS≥6分：高表达组(DLL3- high)，<6分：低表达组(DLL3-low)。根据阳性细胞的百分率进行分组，≥50%的肿瘤细胞表达为高表达组，<50%为低表达组[18]。

三、统计学方法

应用SPSS 24.0版进行数据分析，临床病理特征的组间比较采用χ2检验，应用Kaplan-Meier方法进行单因素生存分析，对数秩和检验 Log-Rank法进行生存曲线比较; 对影响生存期的因素采用Cox比例风险回归模型进行分析。P值小于0.05具有统计学意义。

结果

一、临床特征

本项研究共纳入97例首次诊断为SCLC且未治疗的患者，男性83例，女性14例，男性占比85%，女性占比15%。DLL3表达与常见临床变量的关系见下表(见表1)，其中可见血清NSE与DLL3呈正相关，低DLL3表达和血清NSE<35ng/mL的患者呈现出最佳的生存期。

二、DLL3在SCLC肿瘤组织中的表达情况

DLL3在84.5%(82/97)SCLC石蜡包埋组织中表达，阳性表达为细胞膜出现棕黄色颗粒(见图1)，其中34例(35.1%)患者为高表达，48例(49.5%)患者为低表达，15例为阴性表达。根据上述分组标准，最终34例患者为高表达组，63例患者为低表达组。DLL3表达与血清NSE呈正相关，而与患者性别、年龄、分期、肿瘤大小、化疗周期无相关性(P>0.05)(见表1)。

图1 DLL3在SCLC肿瘤组织中的表达情况(免疫组化 ×200)

表1 DLL3表达与临床病理参数的关系[n(%)]

三、DLL3蛋白表达、血清NSE与SCLC预后的关系

分析预后的指标为无进展生存期(progression-free survival，PFS)，定义为从首次诊断至疾病进展或患者死亡时间。总生存期(overall survival，OS)，定义为从首次诊断到死亡或最后一次随访的时间。DLL3高表达组与低表达组的中位PFS分别为4.2 (区间: 3.1～5.3)和6.6 (区间:5.6～7.6)个月，两组之间的差异具有统计学意义(P=0.009)。中位OS分别为12和12.3个月，两组之间的差异无统计学意义，P=0.940(见图2)。

图2 DLL3蛋白在肿瘤组织中的表达对SCLC患者生存时间的影响

NSE<35ng/mL组的PFS和OS均长于NSE≥35 ng/mL组6.6，5.0个月和15.4，13.3个月，P<0.05(见图3)。为进一步探究DLL3在组织中的表达水平联合血清NSE在评估SCLC预后中的价值，将患者分为4组(组1=DLL3-low + NSE<35ng/mL(n=37)，组2=DLL3-low +NSE≥35ng/mL(n=26)，组3=DLL3-high + NSE<35ng/mL(n=9)，组4=DLL3-high +NSE≥35ng/mL(n=25)。由于第三组样本量较少且失访严重，因此未将组3进行生存比较。在其余三组结果发现低DLL3表达和血清NSE<35ng / L的患者具有最佳生存期(P<0.01)(见图4)。

图3 治疗前血清NSE水平对SCLC患者生存时间的影响

图4 DLL3蛋白表达联合治疗前血清NSE水平对晚期SCLC患者生存时间的影响

四、其他因素对SCLC预后的影响

采用Cox多因素回归模型探究其他因素对SCLC预后的影响，结果显示DLL3的高表达(HR=2.122; 95%CI 1.164～3.868;P=0.014)，女性(HR=0.355; 95%CI 0.127～0.991;P=0.048)和最大肿瘤尺寸>5cm(HR=0.512; 95%CI 0.300～0.875;P=0.014)是SCLC患者PFS的独立危险因素；NSE<35ng/mL(HR=2.676; 95%CI 1.377～5.200;P=0.004)，Ki67在肿瘤组织中的阳性细胞数≤60%(HR=2.199; 95%CI 1.038～4.661;P=0.040)，年龄<70岁(HR=2.206； 95%CI 1.127～4.318；P=0.021)是SCLC患者OS的独立预后因素；肿瘤分期早和规律化疗是PFS和OS的独立预后因素(P<0.001)(见表2)。

表2 SCLC中PFS和OS相关因素的Cox风险回归模型多因素分析

讨论

与非小细胞肺癌相比，小细胞肺癌发现晚，治疗方案有限，易发生早期转移，大部分患者预后较差。且目前临床预测SCLC预后的生物学标志物有限。DLL3作为Notch信号通路的抑制性配体，已有文献报道DLL3与部分肿瘤增殖和侵袭相关，且影响肿瘤预后[19-20]，但目前关于DLL3与SCLC的预后关系的研究尚少，本研究中我们发现DLL3在84.5%的SCLC肿瘤组织中表达，定位于细胞膜，与年龄、性别、肿瘤直径、分期等均无关，与日本的一项研究结果是一致的[18]，但与血清NSE表达呈正相关(P<0.05)。且发现DLL3高表达患者的PFS短于低表达组，而总生存期无显著差异，因此单一的DLL3蛋白表达可能无法有效评估SCLC的预后。已有文献报道血清NSE可用于评估肿瘤预后，但NSE水平受多种因素干扰，多种标志物联合可能有助于提高对预后的预测价值，因此我们首次将肿瘤组织中DLL3表达水平与治疗前血清NSE表达水平联合用于评估SCLC患者预后，结果发现DLL3低表达且血清NSE<35ng / L的患者具有更长的生存期。因此DLL3联合NSE可用于评估SCLC患者的预后。此外，我们还探究其他因素对SCLC患者生存的影响，结果表明肿瘤分期早及规律化疗可改善SCLC的预后，但此项研究是单中心的、样本量相对较少，且肿瘤分期多为Ⅲ/Ⅳ期，缺乏I/II期患者，不可避免的存在选择偏倚，且本实验检测DLL3表达时采用的是免疫组化方法，此方法受实验者技术水平的影响，结果判断方面具有一定的主观性。SCLC患者的预后受多种因素的影响，存在个体差异性，部分患者可能为非肿瘤性死亡，影响最终结果的判断，因此，需要更多的前瞻性、多中心、大样本的临床试验进一步验证本试验结果。