基于生物信息学探讨藏药红景天治疗胃腺癌的有效成分及低氧相关mRNA研究*

杨帅 李根 陈港金 张亮亮 王月 汪红兵,**

（1.首都医科大学附属北京中医医院消化科；2.北京中医药大学研究生院，北京 100010；3.拉萨市人民医院，西藏 拉萨 850000）

胃癌在全球有超过100 万例病例，超过768，000人死亡，在癌症类型中发病率排名第五，死亡率排名第三[1，2]，是最常见和最致命的胃肠道恶性肿瘤之一。胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)是胃癌最常见的组织学类型，占所有胃恶性肿瘤的95%以上，晚期STAD 患者的5 年生存率通常＜5%[3]。由于早期STAD 没有典型症状，大多数患者在临床上被诊断为晚期，通常预后不良。目前手术和化疗治疗是有效的治疗方式，系统性治疗可以缓解局部晚期或转移性疾病患者的症状，提高生存率，改善生活质量[4]。

肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的持续相互作用，在肿瘤的发生、发展、转移和对治疗的反应中起决定性作用[5]。由于肿瘤细胞生长速度过快，由氧消耗增加和氧供应不足之间的不平衡，肿瘤微环境常处于缺氧状态，虽然肿瘤细胞可通过刺激新脉管系统的生长等方式适应缺氧微环境，但同时也导致更具侵袭性和治疗抗性的肿瘤表型。缺氧诱导基因表达的变化和随后的蛋白质组变化，对各种细胞和生理功能产生许多重要影响，最终限制患者预后[6]。因此，改善肿瘤缺氧微环境改变对肿瘤的治疗具有指导意义。藏药红景天是我国民族习用药材，其性平味涩，具有补气清肺、益智养心、收涩止血、散瘀消肿等功效。《神农本草经》记载景天具有“祛邪恶气，补诸不足”之功，李时珍在《本草纲目》中记载红景天为“本经上品，祛邪恶气，补诸不足，为补益之佳品”。在治疗高原缺氧类疾病，诸如急性、慢性缺氧性高原病具有良好的治疗效果，对神经系统、心血管系统、呼吸系统等多个系统具有广泛的药理活性。现多项研究证明红景天不仅具有抗缺氧、抗损伤、抗疲劳、抗抑郁、增强免疫力、促进心肌恢复的作用，而且具有明显的抗恶性肿瘤作用，主要表现在抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞转移、调节肿瘤细胞信号传导、增强机体免疫功能、减少机体炎症反应及提高化疗完成率等方面[7，8]。因此，研究红景天通过作用于低氧相关mRNA治疗STAD具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 STAD 差异相关基因及WGCNA 基因共表达模块的获得

从TCGA 数据库获得转录组数据TCGA-STAD 数据[9]，从GEO 数据库获得转录组数据和临床GEOSTAD 数据[10]。通过R 语言limma 包，设置筛选标准为| log2FC | ＞2、P.Val ＜0.01、FDR ＜0.05，对基因表达量进行规范，筛选出具有差异表达值的基因，通过R 4.2.1 语言的WGCNA 包，构建STAD 加权基因共表达网络[11]。使用函数Pick Soft Threshold 选择软阈值β以建立无标度网络，以基因间皮尔逊相关系数构建邻接矩阵，转换为拓扑重叠矩阵(TOM)及其相关的相似度(1-tom)，构建1-tom 矩阵的层次聚类树将表达高度相关性的基因划分为一个基因模块，分别用不同的颜色表示。通过分析基因模块和临床特征之间的相关热图，将其与数据的临床特征进行整合分析，评估每个模块与正常组、肿瘤组临床特征之间的相关性，并筛选正常组、肿瘤组中差异最大的基因模块，获取TC⁃GA 数据库WGCNA 筛选获得的基因(WGCNA-TC⁃GA)，GEO 数据库WGCNA 筛选获得的基因(WGCNAGEO)。

1.2 低氧相关基因的获得

将关键词“Hypoxia”输入Genecards 数据库，将Relevance score ＞1 作为筛选标准，检索获得低氧相关基因(hypoxia-target)。

1.3 红景天活性成分筛选及有效作用靶点的获得

通过检索ETCM 和HERB数据库收集红景天的化学成分，从文献中检索有效成分作为补充，去除重复值，将有效成分输入Swiss Target 和STITCH 数据库获取药物的作用靶点。

1.4 “药物-成分-疾病-靶点”网络构建与分析

TCGA数据库WGCNA 筛选获得的基因(WGCNATCGA)、GEO 数据库WGCNA 筛选获得的基因(WGC⁃NA-GEO)、低氧相关靶点(hypoxia-target)与红景天有效成分作用靶点(Rhodiola rosea-target)之后，通过R 语言中“venn”“randomcolor”R 包，取四者交集靶点获取韦恩图，获取红景天作用在低氧相关mRNA 靶点上治疗STAD 的作用靶点(Hub-target)。通过Cytoscape 3.7.2 软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，使用network analyzer 功能进行网络特征分析，根据Degree、BetweennessCentrality 预测治疗节点。

1.5 生物功能富集分析

将交集靶点导入利用R 语言“org.Hs.eg.db”“clus⁃terProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“ggnewscale”等相关R包相关功能进行GO分析、KEGG分析。

1.6 红景天治疗胃腺癌核心靶基因的筛选与验证

通过GEPIA2 数据库分析Hub-target 在正常组与肿瘤组有无表达差异[12]，人类蛋白质图谱数据库分析Hub-target 在正常组与肿瘤组中的蛋白差异表达情况[13]，GEPIA2 数据库进一步验证筛选核心基因中STAD 患者总生存期之间的关系，以P＜0.05为差异具有计学意义，将其定义为核心基因。

2 研究结果

2.1 胃腺癌差异相关基因及WGCNA 基因共表达模块

从TCGA 数据库中获得32 个正常样本和375 个STAD 样本；从GEO 数据库GSE13861 中获得19 个正常样本和65 个STAD 样本；通过R 筛语言limma 包筛选差异表达的基因，设置| log2FC | ＞2、P.Val ＜0.01为阈值筛选TCGA-STAD 数据集、GEO-STAD 数据集的差异表达基因，通过R 语言的WGCNA 包构建加权基因共表达网络。对样本进行聚类，去除离群值后绘制样本聚类树。在TCGA-STAD 中选择β=26(R2=0.9)构建无标度网络，共获得中的8个共表达模块(图1C)，我们选取蓝色模块(MEblue)、灰色模块(MEgrey)作为差异基因相关的模块，其中包含12502 个差异相关的基因，见图1A、图1B、图1C。在GEO-STAD 中选择β=3 (R2=0.9)构建无标度网络，共获得中的12 个共表达模块(图1 F)，我们选取绿黄色模块(MEgreenyellow)、紫红色模块(MEmagenta)、橙红色模块(MEsalmon)作为差异基因相关的模块，其中包含619个差异相关的基因，见图1D、图1E、图1F。

2.2 低氧相关基因

通过Genecards 数据库筛选获得低氧相关基因1665个。

2.3 红景天活性成分筛选及有效作用靶点

通过检索ETCM 和HERB 数据库及文献补充，经去重，共收集到红景天活性化学成分38 个，见表1；

表1 红景天有效成分

将有效成分输入Drugbank 数据库、Swiss Target Prediction数据库，共获得387个活性作用靶点。

2.4 “药物-成分-疾病-靶点”网络构建与分析

运用R 语言相关R 包，获得交集基因，如图2 所示，共获得8 个红景天作用在低氧相关mRNA 靶点上治疗STAD“Hub-target”取交集获得ESR2、FABP3、PT⁃GER2、ADA、CA9、CSNK2A1、HPSE、CCNB1 共8 个共表达核心基因。运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，见图3。通过分析节点相连边的数量，即度值（Degree）。获得前5 位的Degree 排名化合物成分为：红景天苷(Degree=10)、正辛醇(Degree=10)、没食子酸乙酯(Degree=8)、山奈酚(Degree=8)、槲皮素(Degree=8)，见表2。通过分析介数中心性(Between⁃ness Centrality)。获得前5 位的BetweennessCentrality排名化合物成分为：红景天苷(Betweenness Centrality=0.0308)、正辛醇(Betweenness Centrality=0.0240)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(Betweenness Centrality=0.0308)、桃金娘醇(Betweenness Centrality=0.0308)、辛酸(Betweenness Centrality=0.0308)，见表3。综合度值及介数中心性分析，红景天苷可能是红景天作用在低氧相关基因上治疗胃腺癌的核心有效成分。

表2 化合物Degree值

表3 化合物Betweenness Centrality 值

2.5 生物功能富集分析

为进一步阐明红景天的作用机制，采用R 语言相关R 包对交集靶点通过GO 功能富集分析，得取生物过程（Biological Process，BP）279 个，细胞组成（Cell Composition，CC）17 个，分子功能（Molecular Function，MF）27 个。按P 值排序（P＜0.05）将前21 条绘图表示，其中条目越长表示富集基因数越多，颜色越红表示药物对疾病的干预越密切，主要涉及染色体分离的调控、碳水化合物衍生物的分解代谢等生物过程；细胞质囊泡腔、囊泡腔、Sin3 复合物、外着丝粒等细胞成分；前列腺素受体活性、腺苷脱氨酶活性等分子过程，见图4A。对关键靶点进行KEGG 通路富集分析，得到3 条信号通路，按P 值排序(P＜0.05)，发现主要涉及氮代谢、糖胺聚糖降解、原发性免疫缺陷通路，见图4B。

2.6 红景天治疗胃腺癌核心靶基因的筛选与验证

GEPIA2 数据库评估Hub-target 在正常组与肿瘤组有无表达差异，发现ESR2、PTGER2、CSNK2A1、HPSE、CCNB1 在肿瘤组中高表达，FABP3、ADA、CA9在肿瘤组中低表达，见图5。通过HPA 数据库验证可获得ESR2、FABP3、ADA、CA9、CSNK2A1、CCNB1 在正常组织样本与肿瘤组织样本中的蛋白表达信息，见图6，经验证，可发现FABP3、ADA、CA9、CSNK2A1、CCNB1在正常组和肿瘤组中蛋白表达与GEPIA2正常组和肿瘤组的蛋白表达一致。通过GEPIA2数据库对Hub-target进行生存分析并通过单变量生存分析图进行展示，其中，蓝色曲线代表基因低表达患者，红色曲线代表基因高表达患者，以P 值代表该基因在高、低表达患者中是否存在显著性差异(P＜0.05)。通过Ka⁃plan-Meier 单变量生存分析显示仅FABP3 的高表达与较差的总生存期(Overall Survival，OS)相关，见图7。综合上述结果，我们发现FABP3 在STAD 组织中表达下调，且FABP3 在肿瘤组中的高表达与STAD 患者总生存期较短相关。

3 讨论

胃癌是临床常见的癌症之一，腺癌是胃癌的主要类型，分为两种组织学亚型：高分化肠型和低分化弥漫型［14］。由于现代饮食方式改变、生活压力增大、细菌感染等因素，使胃癌发病呈现年轻化倾向。胃癌发生从炎症-萎缩-癌变的逐步进展是由多基因、多步骤、多阶段组成的复杂过程，因素多且复杂［15］。早期症状隐匿不易发现，且治疗手段有限，手术和化疗是目前主要的治疗手段，但是副作用较大，严重影响胃癌患者的生活质量，预后通常欠佳［4］。祖国传统民族习药红景天可辅助抗肿瘤治疗［16］，可以有效改善体内缺氧环境，有研究表明，可通过多重效用机制抑制肿瘤细胞的发生发展［17］。因此，需要寻找更好的红景天治疗STAD的有效化学成分及低氧相关作用靶点对特异性预后具有指导意义。

研究结果显示，红景天中共有38 个候选化合物，经过生物信息学分析，其中治疗STAD 最主要的活性是红景天苷。红景天苷是红景天中提取的一种天然活性成分，属于酚类次生代谢物，属于红景天中具有代表性的有效成分。不仅具有抗缺氧、抗衰老、神经保护活性、抗纤维化活性、增强免疫功能、保护机体免受辐射损伤等功能，还具有抗肿瘤等作用。对胃癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等表现出了良好的抗肿瘤活性［8,16］；可以抑制增殖和侵袭、诱导肿瘤自噬及凋亡，通过调控血管生成、克服耐药、化疗增敏、抗炎、增强免疫力来发挥抗肿瘤活性，改善肿瘤微环境［18-20］。

红景天在治疗STAD 中具有8 个与低氧作用靶点的基因，通过生存分析及HPA 数据库验证，发现其中最主要的核心基因为FABP3。FABP3，是脂肪酸结合蛋白(FABPs)家族的一员。FABPs 是一种丰富的细胞内蛋白，可协调细胞内脂质的分布［21］、调节各种代谢、影响肿瘤的生长或增殖、参与炎症途径［22-24］。FABP3在心脏和骨骼肌中表达最高，在胃、脑、肺和乳腺中也有高表达，参与多种细胞功能。在间充质细胞研究中，发现FABP3 在缺氧条件下上调，抑制细胞生长和增殖，增强细胞在缺氧或缺血环境下的存活率［25］。FABP3 可由HIF-1 诱导，并导致缺氧时显著的脂滴积聚。在缺氧-复氧中，抑制脂滴形成增加了ROS 的毒性，降低了体外细胞存活率，抑制体内的肿瘤发生［26］。生物学研究表明FABPs 在胃癌中的作用，表明FABP1/3/4/7 可能是用于胃癌诊断、治疗的潜在靶标，FABP3/4/8 可预示胃癌患者的预后［27］。靶向阻断PD-L1 可降低胃腺癌细胞中FABP4/5 的表达，增加组织常驻记忆T 细胞(Trm 细胞)中FABP4/5 的表达，促进Trm 细胞的脂质摄取，抑制Trm 细胞凋亡，改善胃腺癌预后［28］。这说明FABP3 可能是红景天治疗胃腺癌的低氧相关靶点之一，仍待进一步实验验证。

综上所述，本研究通过ETCM 和HERB 数据库检索、文献补充筛选出红景天的活性成分及作用靶点，通过Genecards 数据库筛选低氧相关mRNA 靶点，结合WGCNA 方法，筛选出8个红景天治疗STAD 低氧相关基因，这些核心基因的主要涉及染色体分离的调控、碳水化合物衍生物的分解代谢等生物过程，主要作用氮代谢、糖胺聚糖降解、原发性免疫缺陷通路。进一步分析发现，红景天治疗STAD 的主要的活性成分为红景天苷，核心靶基因为FABP3，为STAD的诊疗提供新的思路。