基于下呼吸道标本靶向宏基因组测序技术评估西藏高原地区社区获得性肺炎的病原学分布特征

小巴桑 张艳艳 史丹丹 白玛央金 史兴亚 张云桃 贺航咏,2*

（1.拉萨市人民医院呼吸与危重症医学科，西藏 拉萨 850000；2.首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危重症医学科，北京 100020）

社区获得性肺炎(community-acquired pneumo‐nia，CAP)是世界范围内高发病率和高病死率的常见疾病。CAP 占住院患者5%～15%，25%可发展为重症CAP 需入住ICU，死亡率可以高达30～50%［1］。如何早期明确CAP 的病原学，对于早期选择和启动针对性抗生素治疗，缩短患者住院时间和改善预后至关重要。然而，目前临床主要依赖于患者下呼吸道标本的常规微生物检测技术，如微生物的培养、血清学检测和特定病原学的核酸PCR 检测，常常需要较长等待时间，且敏感度和特异度低，并容易遗漏某些常见病原体。因此，寻找新的、更快速、且敏感和准确的病原学检测手段成为CAP 诊治的核心环节。

二代测序技术（next generation sequencing，NGS）以高输出量和高解析度为主要特色，可一次对数百万甚至数千万个DNA 序列进行测序，对DNA 分子进行序列读取，获得丰富的遗传学信息的同时，还可大大降低测序费用、缩短测序时间，可一次检测大量靶基因。NGS 涵盖耐药基因检测，因此可以检出病原体的同时提示可能存在的耐药性，指导临床合理选择敏感抗生素。靶向NGS（tNGS）技术针对呼吸道感染常见病原体进行检测，降低成本同时保持较好的病原学检测敏感性，是针对CAP诊治极有前景的一种快速病原学检测方式［2］。

目前国内外尚无西藏高原地区CAP 患者中应用tNGS 评价感染病原学分布特点的相关研究。因此，本研究拟通过前瞻性队列研究评价基于tNGS 技术分析西藏高原地区CAP 患者下呼吸道病原学的分布特点，为临床经验性选择抗生素提供数据支撑，以期进一步精准指导西藏高原地区CAP 抗生素的合理应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2021 年11 月至2022 年5 月于拉萨市人民医院呼吸与危重症医学科因CAP 住院的患者。1）纳入标准：①年龄18～90岁，男女均可；②符合中国成人社区获得性肺炎诊治指南中CAP的诊断标准；③患者具有明确的基因检测下呼吸道标本如合格深部痰或肺泡灌洗液（BALF）；④受试者自愿加入本研究，签署知情同意书，配合随访。（2）排除标准：①不能留取合格下呼吸道标本；②已明确下呼吸道感染病原体。

1.2 方法

入院后前三天内采集所有纳入患者的下呼吸道标本，首选BALF 标本，如患者无法耐受气管镜检查，可考虑留取合格痰液标本及诱导痰送检。所有下呼吸道标本均同时送检常规病原学检测，包括常规细菌和真菌涂片、抗酸染色、培养（细菌、真菌）及非典型病原体和病毒血清学抗体。所有下呼吸道标本同时送检tNGS。

1.3 主要观察指标

①不同病原体阳性检出率及其分布特点；②不同标本痰和BAFL液的阳性检出率的差异。③不同慢性气道疾病与其他非慢性气道疾病患者的病原学的分布。

1.4 统计学方法

应用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析处理。计数资料以百分率表示（%），BALF 与痰tNGS 检测阳性率相比较采用配对χ2检验。不同基础疾病三组间采用方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

研究期间共测定下呼吸道tNGS样本总数200例，其中BALF 标本161 例，男性83 例（占51.55%），年龄55.80±17.96 岁；痰标本39 例，其中男性15 例（占38.46%），年龄49.92±17.79 岁。依据患者是否存在COPD、支气管扩张或非慢性气道疾病分组，COPD 患者29 例，支气管扩张患者14 例，其他非慢性气道疾病患者157例。

2.2 西藏高原地区tNGS 检测下呼吸道细菌、真菌和非典型病原体的病原学分布特点

如表1 所示，球菌中检出率最高的为肺炎链球菌11.5%（21/200），其次为粪肠球菌7 例（3.5%）；杆菌中检出率最高的为嗜血杆菌属细菌58例（29%），其中流感嗜血杆菌34 例（17%），溶血嗜血杆菌24 例（12%）；其次为大肠埃希菌9 例（4.5%）。真菌中检出最多为白色念珠菌46 例（23%），且在BALF 标本中的检出率显著低于痰标本（15.53% v.s.53.85%，p＜0.001）；其他病原体中最常见为结核分支杆菌24例（12%）；其次为肺炎支原体4 例（2%），且在BALF 中的检出率显著高于痰标本检出率（2.48%比0.00%，p＜0.05）。

表1 200例tNGS检测下呼吸道细菌、真菌和非典型病原体的病原学分布特点

2.3 西藏高原地区tNGS检测下呼吸道病毒的病原学分布特点

如表2所示，在常见呼吸道病毒中，鼻病毒检出率最高，共30 例（15%），其中以A 型鼻病毒为主（16 例，8%）。其次为副流感病毒、冠状病毒和细小病毒B19，各9 例（4.5%），其中细小病毒B19 在BALF 标本中阳性检出率显著高于深部痰标本。偏肺病毒、腺病毒C型及呼吸道合胞病毒也较常检出。在疱疹病毒科中，检出率最高的为EB 病毒73 例（36.5%），其次为人类疱疹病毒7 型45 例（22.5%）和巨细胞病毒34 例（17%）。其中EB 病毒和人类疱疹病毒7 型均在痰液标本中检出率更高。

表2 200例tNGS检测下呼吸道病毒的病原学分布特点

2.4 不同基础疾病tNGS 检测下呼吸道病原学分布特点

如表3 和表4 所示，结核分枝杆菌检出率在COPD 组最高，显著高于支气管扩张组和其他非慢性气道疾病组（55.17%、0.00%、4.46%，p＜0.001）；铜绿假单胞菌在三组患者检出率无显著性差异。巨细胞病毒在COPD 患者中检出率显著低于其他两组。

表3 200例不同疾病tNGS检测下呼吸道细菌、真菌和非典型病原体的病原学分布特点

表4 不同基础疾病患者tNGS检测下呼吸道病毒的病原学分布特点

3 讨论

本研究为首个基于tNGS 评价西藏高原地区CAP患者下呼吸道标本病原学分布特点的前瞻性队列研究。本研究提示西藏高原地区CAP 患者的主要病原学中，细菌以肺炎链球菌和嗜血杆菌属为主，这与国内其他地区的报道相一致。但在引起CAP 的常见病毒分布方面，国内报道以流感病毒、副流感病毒和鼻病毒为主［3,4］，而我们的研究则提示，在西藏高原地区，流感和副流感病毒在CAP 中检出率较低，同时鼻病毒检出率最高，与国外的报道相似［5］。这一结果提示在西藏高原地区鼻病毒可能需要作为CAP 首要病毒类病原学作为考虑和启动早期针对治疗。

非典型病原体如支原体在国内其他地区也被报道为CAP的主要病原体之一，在部分中心CAP患者中非典型病原体检出率可高达18.7%［6］。但在本研究中，肺炎支原体仅占2%，也提示高原地区肺炎支原体可能并非主要CAP 病原体。本研究还发现结核分支杆菌检出率高达12%，提示西藏高原地区影像学提示CAP 时，尤其需要注意与肺结核的鉴别，积极行结核相关病原学检查协助早期确立诊断和启动治疗。

本研究也比较了不同标本类型下不同病原体的检出率，结果发现BALF 中肺炎支原体检出率明显高于痰标本。肺炎支原体肺炎本身分泌物稀少，病原体在痰液标本中可能浓度较低，导致其检出率低；而BALF 可采集来自肺泡的标本，从而提高检出率［7］。因此在怀疑支原体肺炎且痰量较低或不咳痰的患者，应积极考虑行气管镜留取BALF标本以提高病原学的阳性检出率。白色念珠菌通常被视为上呼吸道的正常定植菌。本研究提示白色念珠菌在患者的下呼吸道标本中检出率高，且BALF 标本中的检出率显著低于痰标本。这提示西藏高原地区患者上呼吸道中白念定植率高，易在痰中检出，需谨慎对待痰标本tNGS检出白色念珠菌的结果。

多项研究提示铜绿假单胞菌为慢性气道疾病如COPD 和支气管扩张患者的常见定植和感染病原体［8-11］。本研究对这两类慢性气道疾病患者的tNGS结果与非慢性气道疾病患者进行比较，结果发现铜绿假单胞菌检出率在三组之间无差异。提示高原地区铜绿假单胞菌可能并非导致COPD和支气管扩张合并下呼吸道感染时的首要病原体。同时我们的研究也提示，COPD患者中结核分枝杆菌的检出率明显高于其他两组。这一结果则提示，在高原地区COPD 急性加重入院患者中，需重视对结核分枝杆菌感染的筛查。

西藏高原地区的病毒感染检测能力较弱。本研究通过tNGS 可以早期检出多种病毒，包括常见的呼吸道RNA 病毒。本研究提示西藏地区CAP 的病毒病原体中，流感、副流感、普通冠状病毒、细小病毒B19、偏肺病毒、腺病毒C 型及呼吸道合胞病毒也为常见病毒病原体。疱疹病毒科病毒虽检出率高，但多数未给予治疗患者病情好转，因此考虑定植可能性大［12］。

综上所述，西藏高原地区CAP感染病原体检出类型多样，且有自身地域特点，其中以肺炎链球菌、嗜血杆菌属、白色念珠菌和鼻病毒在各类型病原体中检出率最高。结核分枝杆菌检出率在COPD组最高。需注意依据西藏高原地区不同病原学的分布特点，指导早期经验性应用抗生素。同时在CAP的临床诊疗过程中，tNGS具有较高的敏感性和良好的RNA病毒检出率，有助于早期明确病原学诊断和指导抗生素的精准用药。