茯苓对高尿酸血症大鼠肾损伤及肠道菌群的影响

王 琨，吴珊珊，黎 攀，肖 南，杜 冰

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

随着人民生活质量的提高，饮食结构发生改变，蛋白质及高嘌呤类食物摄入增加，我国高尿酸血症患者数量也逐年增加，2017年高尿酸血症患病率高达13%，且有年轻化趋势[1]。高尿酸血症可引起痛风，同时也是高血压、肥胖、心血管疾病、肾功能衰竭等疾病发生的诱导因素[2-4]。高尿酸血症是由于嘌呤代谢紊乱或尿酸（uric acid，UA）排泄减少导致血液中UA水平增加[5]。人体内约有2/3 UA由肾脏代谢随尿液排出，而另外1/3 UA则由肠道进行代谢随粪便排出，也有少量随汗液排出体外[1]。肠道微生物是肠道重要组成部分，肠道菌群的稳定对肠道健康至关重要[6]。因此保证肾脏健康以及肠道菌群稳定是缓解高尿酸血症的有效途径。目前治疗高尿酸血症常用的药物有黄嘌呤氧化酶抑制剂、UA抑制剂和重组尿酸酶，然而这些药物会产生一定的副作用，如别嘌呤醇会引起严重的过敏反应和皮疹[7]。因此，亟需寻求更加安全有效的替代疗法来预防和治疗高尿酸血症。

食药用菌是和人们日常生活紧密相关的重要生物资源，自古其就以特殊口感和药用价值被纳入食谱和药方中[8]。茯苓通常指多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）的干燥菌核，又称为松柏芋、云苓、伏苓等，是重要的“药食同源”材料[9]。茯苓具有多种生物学功效，如护肝、抗炎、抗癌、抗氧化等[10]。茯苓中主要的化学成分为多糖类、三萜类化合物，同时还含有甾醇、脂肪酸、挥发油等物质[11]。植物中的多糖及三萜类物质均被报道具有抗高尿酸血症活性[12-13]，且防治高尿酸血症的中医药配方中常添加茯苓[14-15]，基于此，推测茯苓具有防治高尿酸血症的功效。目前，对于茯苓的降UA功效以及对肠道菌群的影响报道较少。因此，本实验探讨茯苓粉抗高尿酸血症功效，分析茯苓粉对高尿酸血症大鼠肾脏的保护作用及肠道菌群调节作用，旨在为“药食同源”原材料、地方特色食品、降UA产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级SD雄性大鼠（180～220 g）由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0137。

茯苓购于安徽省六安市金寨县，由华南农业大学肖南实验师鉴定。

UA试剂盒 广州市番禺区华鑫科技有限公司；黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）试剂盒 南京建成生物工程研究所；血清尿素（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）测定试剂盒 上海科华生物工程股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7020型全自动生化分析仪 日本Hitachi公司；Excelsior ES全封闭自动脱水机、HistoStar组织包埋机、HM340E切片机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高尿酸血症大鼠模型的建立

54 只SD雄性大鼠饲养在温度为20～26 ℃、相对湿度为40%～70%的环境下，采用10 h/14 h昼夜循环照明。SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为空白对照组（n＝9）和模型组（n＝45）。空白对照组灌胃生理盐水，模型组SD大鼠每天灌胃200 mg/kgmb腺嘌呤，各组灌胃体积均为5 mL/kgmb；同时每天灌胃2 h后注射质量浓度15 mg/mL氧嗪酸钾溶液（100 mg/kgmb）。连续造模10 d后，眼眶静脉采血，参照UA试剂盒说明书测定大鼠血清UA浓度，UA浓度高于110 μmol/L即为建模成功[16]，得到高尿酸血症大鼠。

1.3.2 茯苓粉制备与动物实验分组

茯苓蒸熟、磨粉后60 ℃干燥，备用。

空白对照（CON）组继续灌胃生理盐水，将上述建模成功的高尿酸血症大鼠随机分为5 组（n＝9）：高尿酸血症模型（HUA）组、模型＋茯苓粉低剂量（HUA＋PCL）组、模型＋茯苓粉中剂量（HUA＋PCM）组、模型＋茯苓粉高剂量（HUA＋PCH）组、模型组＋别嘌呤醇组（HUA＋ALLO）。其中HUA组大鼠每天灌胃生理盐水，HUA＋PCL、HUA＋PCM和HUA＋PCH组大鼠分别每天灌胃0.50、1.00、2.00 g/kgmb茯苓粉（分别配制质量浓度0.1、0.2、0.4 g/mL茯苓粉混合物），HUA＋ALLO组灌胃0.01 g/kgmb别嘌呤醇（配制质量浓度2 mg/mL别嘌呤醇溶液），灌胃体积均为5 mL/kgmb。实验过程中每周记录一次大鼠体质量，给药4 周后，10%（质量分数）水合氯醛麻醉后，通过腹部动脉取血采集大鼠的血液标本进行生化指标测定。安乐处死大鼠，收集大鼠肝脏及肾脏，肾脏称质量，按下式计算肾脏系数，将大鼠肠道内容物收集于无菌离心管，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 血清生化指标测定

分别按照试剂盒说明书测定大鼠血清中UA、BUN、Cr浓度以及XOD活力。

1.3.4 组织器官生化指标测定

取0.50 g的肝脏组织，按1∶9（m/V）加入冰冻生理盐水，用全自动匀浆机制成匀浆液，离心（10 000 r/min、10 min）后取上清液，按XOD试剂盒说明书测定肝脏中XOD活力。

1.3.5 肾脏病理学观察

将收集的大鼠肾脏立即用4%（体积分数）多聚甲醛溶液固定后制片，石蜡包埋后采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在显微镜下对肾小球萎缩、肾小囊扩张、纤维化等病理变化进行观察。同时对肾小管、间质损伤进行评分。评分的内容包括：1）肾小管上皮细胞空泡化；2）肾小管萎缩、扩张；3）肾小管内蛋白管型、细胞管型；4）肾小管内结晶沉积；5）间质炎细胞浸润（淋巴细胞浸润、巨噬细胞聚集、异物肉芽肿反应等）；6）肾间质纤维化。评分标准为：无明显病变，记0 分；病变范围不超过1/4，记1 分；病变范围不超过1/2，记2 分；病变范围不超过3/4，记3 分；病变范围超过3/4，记4 分。每只小鼠的肾损伤评分为6 项得分之和。

1.3.6 16S rRNA高通量测序及肠道菌群分析

收集大鼠肠道内容物，送至天津诺禾致源科技股份有限公司进行16S rRNA高通量测序及肠道菌群分析。采用粪便DNA试剂盒提取结肠内容物中的基因组DNA，将各个样本DNA稀释至相同浓度并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增引物序列为515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[17]。采用Illumina MiSeq平台进行测序，原始测序序列采用Cutadapt软件对各个样本进行质量控制。采用Uparse软件对序列进行聚类分析（97%相似度）得到分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）。利用QIIME（V1.7.0）软件对数据进行分析。

1.4 数据处理与分析

所有数据结果均采用平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学处理，采用t检验进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 茯苓粉对高尿酸血症大鼠体质量、血清UA浓度、XOD活力及肝脏XOD活力的影响

血清UA浓度升高是高尿酸血症的主要特征[18]。如图1所示，造模10 d后模型组SD大鼠血清中UA浓度均高于110 μmol/L，且与空白对照组相比表现出高度显著差异（P＜0.001），表明造模成功，可进行后续实验[16]。

图1 建模后各组大鼠血清UA浓度Fig. 1 Serum UA concentration of SD rats in each group

如图2A所示，干预4 周后各组大鼠的体质量并无显著性差异（P＞0.05）。如图2B所示，与HUA组相比，灌胃茯苓粉的大鼠血清UA浓度高度显著下降（P＜0.001），且呈现一定的剂量依赖性，表明茯苓粉可显著降低高尿酸血症大鼠中UA浓度，从而缓解大鼠的高尿酸血症。此外，干预4 周后HUA组UA浓度低于110 μmol/L，主要是由于干预期间并未给予腺嘌呤和氧嗪酸钾，从而造成HUA组中的UA浓度低于110 μmol/L，并非造模失败，此类现象也在多项研究中均有报道[19-20]。XOD主要在肝脏中表达，增加XOD活力可促进血清UA的产生[21]。因此，本实验进一步测定了血清及肝脏中XOD的活力。结果表明，茯苓粉可显著降低高尿酸血症大鼠血清及肝脏中XOD的活力（P＜0.05）。据此推测，茯苓粉可通过降低XOD的活力从而减少血清UA的产生，达到缓解高尿酸血症的作用。

图2 茯苓粉对高尿酸血症大鼠体质量（A）、血清UA浓度（B）、血清XOD活力（C）及肝脏XOD活力（D）的影响Fig. 2 Effect of P. cocos powder on body mass (A), serum UA concentration(B), serum XOD activity (C) and liver XOD activity (D) in hyperuricemic rats

2.2 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肾功能的影响

如图3A所示，HUA组大鼠的肾脏系数相比于CON组高度显著增加（P＜0.001），即HUA组大鼠的肾脏可能受到损伤，而灌胃茯苓粉后，大鼠的肾脏系数相比于HUA组显著下降（P＜0.05）。BUN、Cr浓度是评价肾功能的重要指标[22]。由图3B、C可知，HUA组的BUN和Cr浓度相比于CON组高度显著升高（P＜0.001），即由腺嘌呤和氧嗪酸钾诱导的高尿血症大鼠肾功能受到损伤。然而，灌胃茯苓粉的高尿酸血症大鼠BUN、Cr浓度相比于HUA组显著降低（P＜0.05），推测茯苓粉可以改善由于高尿酸血症引起的肾功能受损。

图3 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肾脏系数（A）及血清BUN（B）、Cr浓度（C）的影响Fig. 3 Effect of P. cocos powder on renal index (A), serum BUN concentration (B) and serum creatinine concentration (C) in hyperuricemic rats

2.3 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肾脏组织形态的影响

如图4A所示，CON组大鼠肾脏细胞排列整齐，肾小球及肾小管清晰可见，间质间无炎症细胞浸润，组织结构正常。HUA组大鼠肾小管扩张、肾小球萎缩、细胞空泡化，表现为肾脏组织病变。给予低剂量和中剂量茯苓粉的大鼠肾脏组织相比HUA组有明显的改善，但仍出现细胞空泡化、炎症细胞浸润以及轻微的肾小球萎缩。而给予高剂量的茯苓粉后，大鼠肾脏组织病变明显改善。肾脏组织评分结果如图4B所示，低剂量样品组的肾脏损伤评分降低，但与模型组相比无显著性差异（P＞0.05），然而中剂量与高剂量组大鼠的肾脏损伤评分显著低于模型组（P＜0.05）。此外，模型组小鼠的肾小球数目高度显著低于空白组（P＜0.001），而茯苓粉能够增加高尿酸血症大鼠肾脏中肾小球数量。据此推测，茯苓粉能够改善高尿酸血症大鼠的肾脏组织损伤。

图4 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肾脏的影响Fig. 4 Effect of P. cocos powder on renal morphology and function in hyperuricemic rats

2.4 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肠道菌群的影响

2.4.1 肠道菌群多样性

稀释曲线是对样本中的序列进行随机抽取，以抽取的序列数为横坐标，以相对应的OTU数量为纵坐标构建的曲线图。该曲线可用来评判测试的数据量是否合理。当曲线逐渐趋于平坦时，则表明测序的数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息[23]。如图5A所示，每个样本采样的读取数足够大时，曲线逐渐趋于平坦，说明本次实验取样量合理，能够反映出样本中绝大多数微生物信息，可进行后续数据分析。由α-多样性分析可知，各组之间的Shannon指数有轻微的差异，但无显著性差异（P＞0.05，图5B），即各组之间的物种丰富度和多样性无显著性差异。

β-多样性分析可用于研究不同样本中菌群结构的相似性及差异性，常用的分析方法有样本层级聚类分析、主坐标分析以及多维尺度分析[24]。本实验对所有样本基于Bray_curtis距离算法进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。如图5C所示，HUA组与CON组分开聚集，差异明显，即高尿酸血症大鼠的菌群结构与正常小鼠相比具有一定的差异，而灌胃茯苓粉的高尿酸血症大鼠坐标向CON组偏移，表明茯苓粉能够调节高尿酸血症大鼠的肠道菌群组成。相似性分析（analysis of similarities，Anosim）和多响应置换过程分析（multi response permutation procedure，MRPP）是基于OTU相对丰度表分析组间微生物群落结构差异是否显著。如表1所示，灌胃茯苓粉的高尿酸血症大鼠与HUA组大鼠肠道菌群组成具有显著性差异（P＜0.05），表明茯苓粉可以改变高尿酸血症大鼠的肠道菌群结构。以上结果表明茯苓粉能够调节高尿酸血症大鼠的肠道菌群结构。

图5 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肠道菌群多样性的影响Fig. 5 Effect of P. cocos powder on gut microbiota diversity in hyperuricemic rats

表1 大鼠肠道菌群Anosim和MRPP结果Table 1 Analysis of similarities and multi response permutation procedure of gut microbiota in rats

2.4.2 肠道菌群组成

为了进一步探究茯苓粉对高尿酸血症肠道菌群的影响，本实验分析了茯苓粉对大鼠肠道菌群门水平优势菌群的影响。如图6A所示，不同组别中大鼠的优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），占菌落总数的90%以上。与CON组相比，HUA组大鼠中Firmicutes的相对丰度增加，Bacteroidetes的相对丰度减少，而灌胃茯苓粉的高尿酸血症大鼠中Firmicutes与Bacteroidetes的相对丰度与CON组相近。Firmicutes与Bacteroidetes相对丰度比（F/B）被认为是判断肠道菌群紊乱的重要指标[25]。如图6B所示，HUA组的F/B值显著高于CON组（P＜0.05），表明高尿酸血症大鼠的肠道菌群紊乱，而灌胃茯苓粉可使高尿酸血症大鼠的F/B值趋于正常化。因此，茯苓粉可调节高尿酸血症大鼠中门水平上的菌群变化。

在属水平上，各组肠道微生物组成主要是拟杆菌属（Bacteroides）、未知瘤胃球菌属（unidentified_Ruminococcaceae）、罗姆布茨菌（Romboutsia）、未知毛螺旋菌属（unidentified_Lachnospiraceae）、苏黎世杆菌（Turicibacter）、普雷沃氏菌属（Alloprevotella）、乳杆菌属（Lactobacillus），其中Bacteroides、unidentified_Ruminococcaceae为优势菌群（图6C）。与CON组相比，HUA组Turicibacter、布劳特氏菌属（Blautia）、棒杆菌科某属（unidentified_Corynebacteriaceae）等菌群的相对丰度增加，Bacteroides、另枝杆菌属（Alistipes）、副杆菌属（Parabacteroides）、颤杆菌克属（Oscillibacter）等菌群的相对丰度减少。与HUA组相比，茯苓粉灌胃后，Bacteroides、Alistipes、Parabacteroides、Oscillibacter和罗氏菌属（Roseburia）的相对丰度增加，Romboutsia、Turicibacter、Blautia和unidentified_Corynebacteriaceae的相对丰度减少，表明灌胃茯苓粉可调节高尿酸血症大鼠肠道菌群属水平上的菌群变化。

图6 茯苓粉对高尿酸血症大鼠肠道菌群门水平和属水平的影响Fig. 6 Effect of P. cocos powder on gut microbiota composition at the phylum and genus levels in hyperuricemic rats

2.4.3 肠道菌群组成差异性分析结果

采用LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析筛选出组间具有显著性差异的菌群（LDA值大于3），结果如图7A所示，柱状图越长表示差异越显著。门水平上具有显著性差异的菌属如图7B、C所示，HUA组大鼠的Firmicute相对丰度极显著高于CON组（P＜0.01），灌胃不同剂量的茯苓粉后，高尿酸血症大鼠中Firmicute相对丰度均高度显著降低（P＜0.001）。与Firmicute的趋势相反，HUA组大鼠的Bacteroidetes相对丰度显著低于CON组（P＜0.05），而灌胃茯苓粉后，高尿酸血症大鼠中Firmicute相对丰度高度显著升高（P＜0.001），其他研究中也有相似的报道[2]。属水平上具有显著性差异的菌属如图7D～G所示，HUA组大鼠中Bacteroides、Alistipes和Parabacteroides的相对丰度显著下降（P＜0.05），相似结果也在其他研究中有报道[26-27]。而低、中、高剂量组的茯苓粉均可增加高尿酸血症大鼠中的Bacteroides、Alistipes和Parabacteroides的相对丰度。

图7 高尿酸血症大鼠肠道菌群LEfSe分析结果Fig. 7 Linear discriminant analysis effect size of gut microbiota in hyperuricemic rats

3 讨 论

高尿酸血症是导致痛风及其他相关疾病的诱导因素，严重危害人们的生命健康。茯苓作为重要的“药食同源”材料，富含多糖、三萜类等多种生物学活性物质[28]，但是对于茯苓降低UA浓度以及肠道菌群方面的研究甚少。因此，为了响应“健康中国”战略，开发利用“药食同源”材料，改善人体健康，本实验探究了茯苓粉降UA效果，分析了茯苓粉对高尿酸血症大鼠肾脏及肠道菌群的影响，为茯苓相关产品的开发利用以及为缓解高尿酸血症提供新的途径。

高尿酸血症是由于嘌呤代谢紊乱或UA排泄减少而造成机体内UA水平高于正常值的代谢疾病[5]。UA是嘌呤代谢的最终产物，主要以尿酸盐阴离子的形式存在于体内循环中，且UA不能通过食物直接获取，而是摄入含有嘌呤类食物最终通过嘌呤代谢途径生成。XOD是嘌呤代谢过程中的关键酶，催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，黄嘌呤进而氧化为UA，因此抑制XOD的活力能够有效降低血清中UA水平[29]。Qi Xiaofeng等[30]报道乳清蛋白水解物可通过抑制血清和肝脏中XOD的活力来阻止UA的生成。本实验研究结果表明，茯苓粉可降低高尿血症大鼠血清中的UA浓度，同时也能够降低血清和肝脏中XOD的活力。因此，推测茯苓粉可通过抑制XOD的活力从而减少UA的生成，达到降UA的效果。

此外，高尿酸血症发生的同时也会导致肾脏功能受损，然而机体内约有2/3的UA通过肾脏代谢随尿液排出，因此保证肾脏的健康对促进UA排泄至关重要[6]。本实验结果表明，茯苓粉能够显著改善肾脏功能，同时病理学观察也发现茯苓粉能显著改善高尿酸血症大鼠的肾小球萎缩、肾小管扩张以及炎症细胞浸润。因此推测茯苓粉可以通过改善肾脏损伤来促进UA的排泄。

除了从肾脏代谢外，约有1/3的UA在肠道代谢并随粪便排出。肠道菌群作为肠道的重要组成，参与消化、代谢等多种生理学活动。肠道菌群的稳定对肠道健康至关重要，肠道健康可促使机体的UA正常排泄[6]。血液中UA浓度的增加会影响肠道环境，从而引起肠道菌群的变化，反过来肠道菌群的变化也会影响UA的代谢，进一步影响高尿酸血症[6]。研究报道高尿酸血症可导致肠道菌群的结构组成发生改变[31]，这与本实验中β-多样性分析结果一致。Firmicute和Bacteroidetes是肠道菌群中的优势菌群，F/B值是判断肠道菌群紊乱的重要指标[25]。Li Xiaoqing等[2]报道高尿酸血症大鼠中F/B值显著性增加，而绿藻浒苔多糖干预后，大鼠肠道菌群的F/B值显著降低。在本实验中发现，大鼠肠道菌群的优势菌群为Firmicute和Bacteroidetes，高尿酸血症大鼠中F/B值显著升高，而给予茯苓组高尿酸血症大鼠的F/B值显著降低，且与空白组相比无显著性差异，与Li Xiaoqing等[2]的报道结果一致，表明茯苓可调节高尿酸血症大鼠的肠道菌群结构。Bacteroidetes可抑制有害菌在肠道菌群的定植以及增强机体对病毒的抵抗力，对保证肠道健康至关重要[32]，灌胃茯苓粉的高尿酸血症大鼠中Bacteroidetes显著性升高，即茯苓粉可上调肠道菌群中Bacteroidetes的相对丰度。Parabacteroides可将碳水化合物代谢成丁酸，为肠道菌群代谢提供能量，同时可通过分泌细菌素抵御病原体的入侵[33]。Alistipes具有较强的抗炎作用，能够改善肠道炎症，达到保护肠道健康的作用[34]。茯苓粉均可上调Alistipes及Parabacteroides的相对丰度，这与Gao Yan等[27]的结果一致。Lactobacillus是肠道中重要的有益菌，然而灌胃茯苓粉高尿酸血症大鼠中Lactobacillus相对丰度并未明显升高，这可能是由于Lactobacillus不是茯苓粉作用的靶细菌。

综上所述，推测茯苓粉可以通过抑制肝脏和血清中XOD的活力来阻碍UA的产生，以及通过改善肾脏损伤和调节肠道菌群的结构来促进高尿酸血症大鼠的UA排泄，从而降低高尿酸血症大鼠血清中UA浓度，最终达到缓解高尿酸血症的作用。