番茄贮藏气氛3D荧光特征波长小波包选择及腐败预警方法

李建盟，殷 勇，于慧春，袁云霞，李 迎

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023）

番茄是我国主要种植蔬菜作物之一，以其丰富的营养价值和良好的风味深受人们喜爱[1-2]。番茄中较高的水分含量且表面附着的微生物易导致其腐败变质，使货架期缩短[3-4]；若不能及早预警腐败会造成大量经济损失。因此，贮藏期间对番茄品质的监控及早期预警尤为重要。

目前，在番茄的品质监控方面，主要通过硬度、可溶性固形物含量、pH值、总糖含量、番茄红素含量等指标表征番茄品质[5-7]。近些年，近红外光谱、高光谱等技术结合理化指标也逐渐被用于表征番茄品质[8-10]。但是这些方法由于取样的随机性和样本间差异性不能较准确地表征贮藏期间番茄整体质量变化状况。3D荧光技术作为近年来兴起的检测技术，可以实现微量级甚至痕量级的定性及定量分析，并以其灵敏度高、特异性强而广泛应用于众多领域，如医学[11-12]、环境[13-14]、化工[15-16]、食品[17-18]等。3D荧光光谱由激发波长、发射波长及荧光强度组成，其包含了被测对象丰富的信息，有利于获得可靠的分析结果。

不同品种及产地番茄的品质存在差异，但番茄在贮藏期间通过呼吸作用交换到贮藏室气氛中的物质（如醇、醛、酮类等挥发性物质[19-20]）以及表面逸散到气氛中的微生物与其品质变化往往是对应的。微生物内具有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等可产生荧光的物质[21-23]，且醇、醛、酮类等挥发性物质中的苯环结构也可产生荧光信息。因此，利用贮藏室气氛信息可实现番茄贮藏过程中品质变化的监控。贮藏室气氛是一个随机的均匀整体，将贮藏室气氛作为研究对象不仅可以消除取样随机性和样本间差异性的影响，而且能表征番茄贮藏期间整体品质的状况。此外，由于生理盐水不产生荧光，且微生物可在生理盐水中存活，番茄产生的具有羟基和羧基的挥发性物质也可溶于生理盐水，因此生理盐水可作为收集载体，进行荧光检测和分析，以实现番茄品质的监控及早期预警。

番茄属于呼吸跃变型蔬菜[24]，品质变化会出现拐点。基于此，本实验借助贮藏室气氛的荧光信息，运用小波包分解方法选择表征番茄品质变化的3D荧光光谱特征波长，尝试根据特征波长确定番茄的腐败基准，最后以特征波长作为不同贮藏日的光谱表征信息，并运用马氏距离实现番茄腐败的早期预警。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘左粉’番茄于2020年9月13日购于洛阳大张超市，总质量为350 kg。

NaCl（分析纯） 天津市北辰方正试剂厂。

1.2 仪器与设备

HKM-II型空气浮游微生物采样器 广东环凯微生物科技有限公司；TG16A台式高速离心机 上海卢湘仪离心仪器有限公司；紫外增强型三维荧光光谱仪（光源为150 W紫外增强型连续氙灯，波长精准度为±1 nm，信噪比大于800∶1）由实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 荧光光谱采集

采用常温贮藏加速番茄贮藏品质变化。贮藏期间，每天记录贮藏环境温、湿度，贮藏温度波动范围24.5～27.1 ℃，相对湿度波动范围64.0%～66.1%。每天固定时间采集3D荧光数据，为确保腐败基准确定的可靠性，实验截止时间从感官出现腐败（第5个贮藏日）后延续至番茄出现大面积腐烂，使实验数据能更好地覆盖腐败基准。实验共持续8 d。

以0.9 g/100 mL NaCl溶液经121 ℃、20 min灭菌后作为采集贮藏室气氛样本的载体。将采样器置于贮藏库中央，放入装有0.9 g/100 mL NaCl溶液的培养皿采样，气体采样量为1 000 L。采样结束后将样品移至离心管，并用0.9 g/100 mL NaCl溶液定容到4 mL，10 000 r/min离心1 min，弃去2 mL上清液，将剩余样本振荡均匀后进行3D荧光数据采集。激发波长范围200～450 nm，步长5 nm；发射波长范围260～800 nm，步长0.4 nm，积分时间设置为1 s。

1.3.2 光谱预处理

由于采集的3D荧光光谱数据存在瑞利散射[25]，其数值远超光谱区域数值，会掩饰光谱的真实信息，因此采用Matlab2014a软件中eemscat软件包去除瑞利散射。去除瑞利散射后再对光谱进行Savitzky-Golay（S-G）平滑处理[26]。

1.3.3 光谱小波包分解及表征

3D荧光光谱中相邻或相近的激发波长具有相似性和渐变性，相邻激发波长变化不明显。由于小波包分解具有信号“显微放大功能”，因此采用小波包分解将各激发波长对应的发射光谱分解后进行能量值计算，以分析不同激发波长间的差异。以3 层小波包分解为例进行说明，如图1所示，原始信号S经第1层分解得到两个频段，低频段A1和高频段D1；第2层分解时，由A1和D1分解得到AA2、DA2、AD2、DD2这4 个频段，AA2为最低频段，其他频段对应的频率范围依次递增；同理进行第3层分解可得到8 个频段，AAA3为最低频段。小波包分解后得到的每个频段为一个系数集，如式（1）所示。

式中：X为频段对应系数集；m为频段内的系数个数。

各频段信号能量可以用小波包能量表征，各频段小波包能量计算如式（2）所示。

式中：Ej为第j频段小波包能量。

小波包总能量（E）为各个频段能量的总和，如式（3）所示。

式中：n为当前小波包分解层数下频段数量。

各频段小波包能量占比（P）按式（4）计算。

图1 3 层小波包分解示意图Fig. 1 Schematic diagram of three-layer wavelet packet decomposition

小波包分解中，基函数和分解层数的选择对于光谱信息的表征具有一定影响，根据已有研究，选择4 阶Symlet小波作为小波基函数[27]。另外，小波包分解层数太少不利于表征光谱特征信息，分解层数过多会导致计算量过大和有用信息丢失，因此选择3 层分解。

小波包能量可表征光谱信息，而光谱能量主要集中在低频段，高频段一般为噪声和干扰；低频段小波包能量占比越高表明对应的激发波长更能反映光谱的真实信息。经计算发现，小波包分解后最低频段的小波包能量占比最高，因此，用最低频段的能量值作为激发波长的表征量，通过分析最低频段的小波包能量表征荧光光谱中各激发波长下光谱的变化状况。

1.3.4 特征激发波长的选择

1.3.4.1 特征激发波长初选

采集的3D荧光光谱中含有冗余信息，需提取可表征番茄品质变化的特征波长。为筛选有用的荧光区域激发波长，将最低频段小波包能量占比超过99%所对应的激发波长作为有用荧光区域信号，而低于此值舍去。利用最低频段小波包能量占比实现激发波长的初选。

1.3.4.2 特征激发波长终选

以初选后各激发波长对应发射光谱小波包分解的最低频段能量值作为表征量，绘制不同激发波长-对应能量值的变化曲线。能量曲线中峰值一侧能量值波动大，另一侧则变化平稳、波动小。能量波动大的一侧所反映的光谱变化规律不明显；而能量波动小的一侧，光谱变化规律性较强。因此，选择曲线峰值波动小的一侧所对应激发波长作为特征激发波长范围。

1.3.5 特征发射波长的选择

数据采集时发射波长步长为0.4 nm，剔除无荧光信息背景区域后仍有726 条发射波长，发射波长数量多不利于分析。在化工[28]、环境[29]、食品[30]等领域研究中，3D荧光发射波长步长一般设置为1、2、5 nm。而本研究中发射波长步长为0.4 nm，虽分辨率高可细化光谱，被测对象可被更精细描述，但考虑到相邻波长的相似性和渐变性，可将相邻波长进行归组，对特征激发波长下的发射光谱进行波段划分，通过对各波段的分析选取特征发射波长。采用取整原则，由于发射波长2 nm尺度中仅包含5 个步长，数量过少不足以表征荧光信息，因此选择尺度为4、8、12 nm进行波段划分，通过对比分析确定波段尺度。

将每个波段中发射波长按对应激发波长从小到大顺序首尾相连构成一个新的数据链，分别对各波段相应数据进行3 层4 阶Symlet小波包分解，以其小波包分解最低频段的能量值作为该波段的表征量，特征激发波长下发射光谱可表征为各波段对应的小波包表征能量变化曲线。小波包能量值大表明其对应波段信号强，信息更为丰富，因此，选取不同贮藏日表征能量变化曲线峰值所对应的波段进行特征发射波长的选择。

1.3.6 腐败基准的确定

贮藏期间番茄品质不断变化，当番茄品质达到腐败状态时，腐败前后荧光光谱信息不同，表现为荧光光谱值出现异常或突变。所有特征激发波长对应能量值的总和即为该贮藏日样本光谱检测的表征量。当能量总和变化出现突变或拐点时即表明荧光光谱信息出现突变，说明番茄开始出现腐败，由此确定腐败基准。

此外，由于番茄腐败前后荧光光谱信息不同，采用欧氏距离对不同贮藏日特征激发波长下发射光谱的表征能量值进行聚类分析。将每日所采集番茄荧光光谱信息作为单独一类，计算类间欧氏距离，并将距离最小的两类合并为一个新类，然后计算新类和其他类的距离再进行合并，重复此过程至仅剩两类。最后这两类即为腐败前、后的光谱信息表征。

运用特征激发波长对应能量值总和的变化与特征发射波长光谱表征能量值的聚类分析两种方法可最终确定腐败基准；并且这两种方法所得结果的一致性可充分说明腐败基准的准确性和合理性。

1.3.7 根据腐败基准反选特征发射波长

根据1.3.5节所述，以各贮藏日能量变化曲线峰值对应波段进行特征发射波长的选择，而不同贮藏日能量变化曲线峰值对应波段不同，因此，为进一步缩小范围，按照1.3.6节方法，采用欧氏距离对不同贮藏日特征激发波长下发射光谱的表征能量值进行聚类分析，选择腐败前、后两类距离最大波段中的发射波长作为终选特征发射波长，以此实现运用腐败基准反选特征发射波长，并最终确定特征发射波长。

1.3.8 早期腐败预警

腐败基准确定后，可用腐败基准日的特征发射波长光谱表征能量值作为基准信息向量，计算腐败基准日前各贮藏日特征发射波长光谱表征能量值到基准信息向量的马氏距离。马氏距离越大，表明番茄品质越好，远未达到腐败状态；马氏距离越小，表明番茄品质越差，越接近腐败状态。根据马氏距离实现番茄的品质监控及早期预警。马氏距离按式（5）计算。

式中：D为第i个贮藏日特征发射波长光谱表征能量值到基准信息向量的马氏距离；xi（x1,x2, …,xm）表示第i个贮藏日特征发射波长光谱表征能量值；y为腐败基准日特征荧光光谱信息向量；S为腐败基准日特征荧光光谱信息向量的协方差。

综合上述研究方法，番茄贮藏过程中，基于贮藏气氛的3D荧光特征波长选择方法及实现腐败预警的研究流程如图2所示。

图2 基于贮藏气氛的3D荧光特征波长选择方法及实现腐败预警的研究流程Fig. 2 Flow chart of tomato spoilage early warning based on 3D fluorescence feature wavelength selection of storage room gas

2 结果与分析

2.1 光谱预处理结果

如图3A所示，原始3D荧光光谱仅可观察到一道散射墙，其荧光强度远超周围荧光区域，无法获取有用信息。对原始光谱数据进行去除瑞利散射和S-G平滑处理，图3B显示出荧光信号区域及荧光峰的位置，有利于后续研究。

图3 原始（A）和去除瑞利散射、S-G平滑处理后（B）荧光光谱Fig. 3 Original fluorescence spectra (A), and fluorescence spectra subjected to Rayleigh scattering removal and S-G smoothing (B)

2.2 特征激发波长选择结果

2.2.1 特征激发波长初选结果

对3D荧光光谱进行分析时发现，发射波长550～800 nm为背景区域，不存在荧光信号，因此去除。将各激发波长对应的发射光谱进行小波包分解，小波包分解产生频段的能量占比如图4所示。荧光区域300 nm激发波长对应发射光谱最低频段的能量占比超过99%，其他频段能量占比极小；而非荧光区域215 nm激发波长对应发射光谱虽然最低频段能量占比最高，但是与荧光区域差异较大。最低频段能量占比显示了不同激发波长间差异性，以最低频段能量占比超过99%为准则，选取激发波长范围260～405 nm中30 个激发波长作为初选激发波长。

图4 荧光区域300 nm激发波长（A）和非荧光区域215 nm激发波长（B）对应发射光谱的小波包能量占比Fig. 4 Wavelet packet energy ratio of emission spectra corresponding to excitation wavelength of 300 nm in fluorescent region (A) and 215 nm in non-fluorescent region (B)

2.2.2 特征激发波长终选结果

如图5所示，不同贮藏日的能量曲线峰值对应的激发波长各不相同，图中右侧能量曲线变化趋势平稳，所以选择靠近右侧峰值对应的激发波长335 nm作为选取激发波长的基点，共选取基点右侧包括335 nm在内的15 个激发波长。

图5 不同贮藏日特征激发波长-对应能量值的变化曲线Fig. 5 Variation curves of wavelet packet energy versus feature excitation wavelength at different storage times

2.3 特征发射波长选择结果

以12 nm尺度划分的波段为例，对该波段相应数据进行小波包分解，不同贮藏日特征激发波长下发射光谱该波段对应的小波包能量变化曲线如图6所示。贮藏过程中不同贮藏日波段对应的能量变化曲线峰值在第10～14个波段之间，因此选择第10～14连续5 个波段中的发射波长作为特征发射波长。

图6 不同贮藏日特征激发波长下发射光谱波段对应的小波包能量变化曲线（划分尺度12 nm）Fig. 6 Variation curves of wavelet packet energy versus emission spectral bands corresponding to different feature excitation wavelengths at different storage times (wavelength intervals 12 nm)

以尺度4、8、12 nm对特征激发波长下发射光谱进行波段划分，各波段对应发射光谱进行小波包分解，以最低频段能量作为波段表征量，特征激发波长下发射光谱可表征为各波段对应的能量变化曲线。能量变化曲线峰值对应波段的发射波长范围如表1所示。整个贮藏过程中，尺度4、8、12 nm划分波段能量变化曲线峰值对应发射波长范围分别为376～416、372～428、368～428 nm。因尺度4 nm和8 nm选取的发射波长范围包含在尺度12 nm所确定的发射波长范围内，故取12 nm作为最终波段划分尺度。尺度12 nm所确定发射波长范围368～428 nm作为特征发射波长。

表1 不同贮藏日特征激发波长下发射光谱能量变化曲线峰值对应波段发射波长Table 1 Emission wavelength corresponding to peak values of emission spectral energy change curves at different feature excitation wavelengths at different storage times nm

2.4 腐败基准确定结果

2.4.1 能量总和变化确定的腐败基准

所有特征激发波长下发射光谱小波包分解最低频段能量值的总和即为该贮藏日样本光谱检测的表征量。由图7可知，随着贮藏时间延长，能量总和呈下降趋势。第5个贮藏日开始曲线变化趋于平稳，说明荧光光谱信息在第5个贮藏日出现拐点，表明番茄品质变化达到腐败状态。因此，确定第5个贮藏日为腐败基准日。

图7 不同贮藏日特征激发波长下发射光谱小波包分解最低频段能量总和变化Fig. 7 Changes in the lowest wavelet packet frequency band energy of emission spectra corresponding to different feature excitation wavelengths as a function of storage time

2.4.2 腐败基准确定结果

采用欧氏距离对不同贮藏日特征激发波长下发射光谱表征能量值进行聚类分析。由图8可知，第1～4个贮藏日的荧光光谱特征信息聚为一类，第5～8个贮藏日聚为一类，说明前4 个贮藏日的荧光光谱特征信息相近，而在第5个贮藏日番茄品质发生变化，因此确定腐败基准日为第5个贮藏日。

图8 不同贮藏日特征激发波长下发射光谱表征能量值的聚类分析Fig. 8 Cluster analysis of energy values of emission spectra at different feature excitation wavelengths as a function of storage time

2.5 腐败基准反选特征发射波长结果

根据能量变化曲线峰值选取的特征发射波长在第10～14个波段（划分尺度12 nm）中（图6），对各波段对应发射波长光谱表征能量值进行聚类分析，发现第11个波段对应发射波长光谱表征能量值聚类分析腐败前、后的距离最远，说明此波段的发射波长能够最优表征贮藏过程中番茄品质的变化。第11个波段对应发射波长光谱表征能量值聚类分析结果如图9所示，第1～4个贮藏日为腐败前光谱信息，第5～8个贮藏日为腐败后光谱信息，与能量总和变化确定的腐败基准结果相印证。因此，选择第11个波段中的发射波长作为荧光光谱的特征发射波长。

图9 最优波段对应发射波长光谱表征能量值的聚类分析Fig. 9 Cluster analysis of spectral energy values of emission wavelengths corresponding to optimal band

2.6 马氏距离对番茄早期腐败的预警结果

由图10可知，随着贮藏时间延长，贮藏日特征发射波长光谱表征能量值到基准信息向量的马氏距离呈下降趋势，表明番茄逐渐趋于腐败，当马氏距离接近零时说明番茄开始腐败。虽然随着贮藏的进行，腐败基准距离出现波动，但整体呈下降趋势，因此应用马氏距离的变化进行番茄贮藏过程中品质的监控及早期预警可行且有效。

图10 腐败前各贮藏日与腐败基准间的马氏距离变化趋势Fig. 10 Trend of Mahalanobis distance between storage days before spoilage and spoilage benchmark as a function of storage time

3 结 论

通过采集不同贮藏时间番茄贮藏室气氛3D荧光光谱数据，经原始光谱数据去除瑞利散射、平滑和剔除无信息荧光背景区域处理，对每个激发波长对应发射光谱进行小波包分解，以最低频段小波包能量占比进行特征激发波长初步筛选，再根据激发波长小波包能量变化优选出15 个特征激发波长。然后，以尺度12 nm对特征激发波长下发射光谱进行波段划分，在获取波段小波包能量变化曲线峰值的前提下，选取5 个峰值波段中的发射波长作为特征发射波长。在此基础上，根据不同贮藏日，运用特征激发波长对应能量值总和的变化与特征发射波长光谱表征能量值的聚类分析均可确定第5个贮藏日为番茄腐败基准日。另外，根据腐败基准前、后信息欧氏距离反选特征发射波长，进一步筛选出最优波段对应发射波长作为终选特征发射波长。最后，将腐败前各贮藏日与腐败基准间的马氏距离用于监控贮藏过程中番茄品质变化及腐败预警。结果表明，运用小波包分解可选择特征激发和发射波长，根据特征激发波长下发射光谱的总能量变化及其聚类分析两种方法均可确定准确、可靠的腐败基准，且所建立的马氏距离预警方法具有可行性。以贮藏室气氛作为研究对象克服了取样随机性和样本间差异性的影响，使研究结果更具有鲁棒性。