伯氏疟原虫ANKA株感染小鼠的T细胞、NK细胞及细胞因子变化

张义伟，苏紫薇，李其龙，陈 冉，姜 宁

(重要家畜疫病研究教育部重点实验室 沈阳农业大学动物科学与医学学院，沈阳 110866)

疟疾是由疟原虫引起的世界上危害最严重的疾病之一。据WHO报告统计，自青蒿素的普及以来，全球疟疾控制取得了前所未有的成功，但每年仍有超过40万人死于疟疾。一方面和最近几年出现的抗青蒿素虫株有关[1-3]；另一方面，和疟原虫复杂且精密的免疫逃避方式有关。这表明，寻找有效的药物靶标及开发疟疾疫苗迫在眉睫。已有研究表明，针对抗疟原虫免疫反应方面设计的药物，可以有效地控制疟原虫在所有发育阶段的感染[4]。因此，研究疟原虫感染引起宿主的免疫反应过程尤为重要。

疟原虫在宿主体内寄生可引起强烈的免疫应答反应，免疫机制复杂多样。T细胞是清除机体疟原虫的重要组成部分[5-6]，可通过直接产生如IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子，引发巨噬细胞和其他组分的抗寄生虫免疫应答[7]，或激活产生抗疟原虫抗体的特异性B细胞从而介导间接的抗寄生虫免疫反应[8]。NK细胞可通过细胞毒性和产生促炎细胞因子来破坏受损、功能失调或被感染的宿主细胞，从而控制感染的进程[9]。在机体的免疫清除进程中，T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3, Tim-3)作为一种免疫检查点分子，对T细胞和NK均具有负性调节功能[10-12]，在肿瘤以及一些病原体的免疫逃避进程中发挥着重要作用。

在所有人类疟原虫感染中，恶性疟原虫引起的疾病是导致死亡的主要因素，感染后常出现脑型疟的症状。而可以感染小鼠的伯氏疟原虫ANKA株是一种致命的强毒力虫株，已有的研究表明，在恶性疟原虫感染的患者和伯氏疟原虫ANKA株感染的C57BL/6小鼠的体内，关键免疫细胞表面Tim-3表达均升高[13]，但整个感染进程中Tim-3的表达变化及相关细胞因子的变化还未可知。一项在昆明小鼠体内的研究显示：利用荧光定量PCR检测技术，发现感染伯氏疟原虫ANKA株后，小鼠脾Tim-3、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β的转录水平均升高[14]，但这些仅是在转录水平上的变化情况，此外，不同品系小鼠感染疟原虫引起的病理和免疫反应也存在差异[15-16]。伯氏疟原虫ANKA株感染C57BL/6小鼠后也常会引起脑型疟发生，故已被广泛用作研究人类恶性疟疾疾病的试验模型。因此，本研究以伯氏疟原虫ANKA株和C57BL/6小鼠为试验材料，对疟原虫感染引起的宿主免疫应答特点进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与虫株 SPF级雌性C57BL/6小鼠(N型)，鼠龄6～8周龄，体重20～22 g，购自辽宁本溪长生生物技术有限公司。

伯氏疟原虫ANKA株由沈阳农业大学动物科学与医学学院人畜共患病重点实验室保存。

1.1.2 抗体 Pacific BlueTManti-mouse CD45 Antibody、APC anti-mouse CD3 Antibody、FITC anti-mouse CD8a Antibody、APC/FireTM750 anti-mouse CD4 Antibody、FITC anti-mouse NK1.1 Antibody、PE anti-mouse CD366 (Tim-3) Antibody、Pacific BlueTMRat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、APC/FireTM750 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、APC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody、PE Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody、LEAFTMPurified anti-mouse CD16/32 Antibody、7-AAD Viability Staining Solution和Mouse Th Cytokine Panel (5-plex)细胞因子检测试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 以感染伯氏疟原虫强毒株ANKA株的C57BL/6小鼠为研究对象，分别于感染后0、4、7、9、11、13、16和19 d采集小鼠脾及外周血免疫细胞，利用流式细胞术检测小鼠主要免疫细胞亚群及Tim-3的表达水平的变化，同时检测血清中细胞因子水平的变化(图1)。

图1 试验分组及试验流程

1.2.2 虫株的准备 将伯氏疟原虫ANKA株从液氮罐中复苏，离心洗涤后将虫体迅速腹腔注射至C57BL/6小鼠体内。大约3 d后采取尾尖血制作血涂片，Giemsa染色检测染虫情况。约5 d后采集尾尖血至预冷的1×PBS中准备接种下一批小鼠，这批小鼠为第二代染虫小鼠。如此反复传三代，待虫株毒力稳定后，即可用于后续感染模型建立试验。

1.2.3 伯氏疟原虫ANKA株感染模型的建立 第三代染虫小鼠体内染虫率到达2%～3%时，取小鼠外周全血准备攻虫：64只雌性C57BL/6小鼠随机分为8组：0 d组、4 d组、7 d组、9 d组、11 d组、13 d组、16 d组和19 d组，每组8只。除8只健康小鼠(即0 d组)外，其余小鼠每只腹腔注射 2×105个染虫红细胞，在相同的环境中饲养。

1.2.4 样本的采集 利用眼球采血的方法采集小鼠外周血，其中一部分放于抗凝管中用于免疫细胞的流式细胞术检测，一部分用于血清的分离。小鼠断颈处死，采取脾并称重。分离的血清置于-80 ℃冰箱保存，用于检测细胞因子。

1.2.5 脾单细胞悬液的制备 将脾放置于200目细胞筛，置于50 mL离心管上，边加PBS边用注射器尾部充分研磨；研磨好的细胞悬液转移至15 mL离心管中，1 500 r·min-1离心7 min，弃上清，根据沉淀体积加入3～10 mL的红细胞裂解液，充分震荡混匀，冰上孵育3～5 min；1 500 r·min-1离心7 min后弃掉上清，沉淀用10 mL的1×PBS 重悬，重复2次。显微镜下计算细胞数量。

1.2.6 流式细胞术检测不同免疫细胞亚群 从每只小鼠采取的抗凝血中取出100 μL加入离心管中，之后加入相应的抗体组合，充分混匀；4 ℃避光孵育30 min后，加入红细胞裂解液裂解红细胞，冰上孵育3 min，1 500 r·min-1离心7 min后弃上清；加入1 mL 1×PBS重悬细胞，离心，弃上清；加入300 μL 1×PBS重悬细胞，将细胞悬液通过200目滤网，准备上机检测。

将脾细胞悬液调整每管细胞的终浓度为每100 μL含1×106个细胞；加入CD16/32抗体，冰上孵育10 min封闭Fc位点；将上述细胞每管取100 μL加入离心管中；加入相应的抗体组合，充分震荡混匀；4 ℃避光孵育30 min，离心，清洗3遍。最终，加入300 μL 1×PBS重悬细胞，细胞悬液通过200目滤网，上机检测。

1.2.7 血清中细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10)的检测 按照试剂盒说明书方法进行操作。

1.2.8 统计与分析 所有分析均使用GraphPad Prism 6进行。多组间比较时，采用双尾t检验或方差分析对结果进行分析。结果使用Excel进行计算，以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 感染伯氏疟原虫不同时期小鼠脾指数变化

如图2所示，感染伯氏疟原虫后小鼠的脾指数(脾指数=脾重量(mg)/体重(g)×10)在0～13 d逐渐升高(P<0.001)；16～19 d小鼠脾指数不再继续升高，感染19 d小鼠与16 d小鼠相比，脾指数降低(P<0.05)，但仍显著高于健康对照组(0 d组)(P<0.001)。

&. P<0.05, ***. P<0.001, *代表与0 d组进行比较；& 代表19 d组与16 d组进行比较

2.2 感染伯氏疟原虫不同时期小鼠脾中T细胞及T细胞表面Tim-3的表达情况

利用流式细胞术检测伯氏疟原虫ANKA株感染小鼠后脾T细胞主要亚群比例及Tim-3的表达情况的变化，图3A为细胞圈门方案。与未感染组(0 d组)相比，感染4 d，小鼠脾CD3+CD4+T细胞比例显著降低(P<0.001)，且随感染时间的延长，除7 d外，脾CD3+CD4+T细胞比例均显著低于0 d未感染组(图3B)。与未感染组(0 d组)相比，小鼠脾CD3+CD8+T细胞比例随感染时间的延长逐渐降低(P<0.001,图3C)。如图3D和图3E所示，随感染时间延长，小鼠脾Tim-3+CD3+CD4+T细胞和Tim-3+CD3+CD8+T细胞比例逐渐升高(P<0.001)。为了进一步确认CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞表面Tim-3的表达情况，利用流式细胞术检测了这两种细胞表面Tim-3分子的平均荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)。结果显示，Tim-3分子在CD3+CD4+T细胞(图3F)和CD3+CD8+T细胞(图3G)表面的表达均逐渐增加。

A. 流式细胞圈门方案； B. CD3+CD4+ T细胞比例统计结果；C. CD3+CD8+ T细胞比例统计结果；D. Tim-3+CD3+CD4+ T细胞比例统计结果；E. Tim-3+CD3+CD8+ T细胞比例统计结果；F. Tim-3在CD3+CD4+ T细胞的表达变化；G. Tim-3在CD3+CD8+ T细胞的表达变化。*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, *代表与0 d组进行比较。下图同

2.3 感染伯氏疟原虫不同时期小鼠外周血中T细胞及T细胞表面Tim-3的表达情况

采用流式细胞术检测伯氏疟原虫ANKA株感染小鼠的外周血T细胞主要亚群比例及Tim-3的表达情况的变化。结果显示：与未感染组(0 d组)相比，感染4 d，小鼠外周血CD3+CD4+T细胞比例显著升高(P<0.001)，在感染第7和第9天又逐渐降低(P<0.001)，在感染第16和第19天逐渐升高(P<0.01)，整体呈先降低后升高的趋势(图4A)；与未感染组(0 d组)相比，感染4 d小鼠外周血CD3+CD8+T细胞比例显著降低(P<0.001)，在感染的第7和第9天又逐渐升高(P<0.001)，在感染的第16和第19天均发生降低(P<0.05、P<0.001)，整体呈先升高后降低的趋势(图4B)。如图4C和图4D所示，随感染时间的延长，小鼠外周血Tim-3+CD3+CD4+T细胞和Tim-3+CD3+CD8+T细胞比例均呈先升高后降低的趋势(P<0.01)，但感染末期Tim-3+CD3+CD4+T细胞和Tim-3+CD3+CD8+T细胞的比例仍显著高于未感染组(0 d组)。利用流式细胞术检测的外周血中这两种细胞表面Tim-3分子的MFI，如图4E和图4F所示：Tim-3分子在CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞表面的表达均呈先升高后降低的趋势，但感染末期Tim-3分子的表达量也均高于未感染组(0 d组)。

A. CD3+CD4+ T细胞比例统计结果；B. CD3+CD8+ T细胞比例统计结果；C. Tim-3+CD3+CD4+ T细胞比例统计结果；D. Tim-3+CD3+CD8+ T细胞比例统计结果；E. Tim-3在CD3+CD4+ T细胞的表达变化；F. Tim-3在CD3+CD8+ T细胞的表达变化

2.4 感染伯氏疟原虫不同时期小鼠脾中NK细胞及NK细胞表面Tim-3的表达情况

利用流式细胞术检测小鼠脾中NK细胞及NK细胞表面Tim-3的变化，图5A为流式圈门方案。如图5B所示：与未感染组(0 d组)相比，感染4 d，小鼠脾CD3-NK1.1+细胞比例显著降低(P<0.001)，感染第11天比例降到最低(P<0.001)，感染第13～19天逐渐升高，但CD3-NK1.1+细胞的比例仍显著低于未感染组(0 d组)。与未感染组(0 d组)相比，感染4 d，小鼠脾Tim-3+CD3-NK1.1+细胞的比例显著升高(P<0.01)，感染的第11天比例升到最高(P<0.001)，随后逐渐降低，但感染后期脾Tim-3+CD3-NK1.1+细胞仍显著高于未感染组(图5C)。在感染疟原虫后，小鼠脾CD3-NK1.1+细胞细胞表面的Tim-3分子的表达量均显著高于未感染组(图5D)。

A. 流式细胞圈门方案； B. CD3-NK1.1+ 细胞比例统计结果；C. Tim-3+CD3-NK1.1+ 细胞比例统计结果；D. Tim-3在CD3-NK1.1+ 细胞的表达变化。*. P<0.05, **. P<0.01, ###、***. P<0.001, *.代表与0 d组进行比较，#.代表19 d组与16 d组进行比较

2.5 感染伯氏疟原虫不同时期小鼠外周血中NK细胞及NK细胞表面Tim-3的表达情况

小鼠外周血中CD3-NK1.1+细胞的比例在感染后第4天发生显著升高(P<0.05)，随后降低，直至感染末期，且在感染的第9～19天，CD3-NK1.1+细胞的比例均显著低于未感染组(P<0.001,图6A)。外周血Tim-3+CD3-NK1.1+细胞的比例在感染后显著升高(P<0.001，图6B)。流式细胞术MFI结果显示：外周血中，CD3-NK1.1+细胞表面Tim-3分子的表达量呈不规则升高趋势，感染末期升至最高(图6C)。

A. CD3-NK1.1+ 细胞比例统计结果；B. Tim-3+CD3-NK1.1+ 细胞比例统计结果；C. Tim-3在CD3-NK1.1+细胞的表达变化。*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, *.代表与0 d组进行比较

2.6 血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的检测结果

利用细胞因子微球检测技术检测了小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的分泌情况。如图7A和图7F，感染疟原虫后的第4天，血清中IFN-γ的分泌急剧增多，且差异极显著(P<0.001)，之后逐渐降低，直至感染的第13～19天, IFN-γ的分泌量与未感染组几乎相同(P>0.05)；图7B和图7F为血清中IL-2的分泌情况，结果显示感染疟原虫后的第4～19天，血清中IL-2的分泌量均显著高于未感染组(P<0.05)；如图7C、图7D和图7F所示，感染疟原虫后，小鼠血清中IL-6和TNF-α的分泌均出现了先升高后降低的趋势(P<0.05)。血清中IL-10的含量在小鼠感染疟原虫后逐渐升高，且在感染末期达到最高(P<0.001,图7E、图7F)。

A～E. 血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10的检测结果统计；F. 对血清中IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10检测数据进行的热图分析结果。*. P<0.05, **. P< 0.01, ***. P<0.001, *.代表与0 d组进行比较

3 讨 论

脾是机体重要的免疫器官，在机体的造血和免疫监视功能中都起着非常重要的作用，脾肿大可能是严重疾病的第一个征兆[17]。本研究发现，在感染疟原虫第4天小鼠脾肿大非常明显，且随感染时间的延长，小鼠脾持续增大。脾的功能之一是清除异常红细胞，因此，这可能意味着在感染疟原虫的小鼠脾中存在更多的受感染红细胞。此外，本研究发现感染疟原虫小鼠脾非淋巴细胞亚群的细胞比例显著增多，而已有研究表明，脾肿大与非淋巴细胞(例如中性粒细胞)的脾浸润有关[17]，这也可能是导致本研究中小鼠脾增大的原因之一。

T细胞是清除红内期疟原虫的重要组成部分[5]，可产生如IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子，从而引发巨噬细胞和其他组分的抗寄生虫免疫应答[7]。本研究显示,外周血T细胞，尤其是CD3+CD8+T细胞在感染前期显著升高，而血清中的IFN-γ的分泌量也在此时达到最高。除T细胞外，IFN-γ也可由NK细胞产生，是NK细胞清除疟原虫所必需的细胞因子[18]，NK细胞通过细胞毒性和产生促炎细胞因子来破坏受损、功能失调或被感染的宿主细胞，从而控制疟原虫感染的进程[9]。本研究发现，感染早期外周血NK细胞的比例也达到了最高。具有抗虫活性的TNF-α也可通过活化的巨噬细胞分泌[19-20]。IL-2也是一种促炎细胞因子，因其具有促进T细胞体外增殖和分化的能力而被命名为T细胞生长因子(T cell growth factor，TCGF)。IL-2主要由活化的T细胞产生，尤其是活化的CD4+T细胞[21]。IL-6主要由单核巨噬细胞、Th2 细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等产生，可与 IL-1 一起协同促进 T 细胞增殖，它还可促使 B 细胞分化。疟原虫红内期感染期间，IL-6可以促进CD4+T细胞活化和B细胞应答反应及分化，刺激早期疟原虫特异性IgM的产生，是疟原虫感染期间免疫应答的重要组成部分[22]。在本研究中，血清IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌在感染疟原虫后显著升高，在感染后4、7或9 d达到最高水平，表明机体此时在进行积极的抗虫免疫反应。

然而，疟原虫感染会引起T细胞的耗竭[23]。已有研究表明，在疟原虫感染中，表达Tim-3的T细胞亚群比例升高，而阻断Tim-3可增强宿主介导的细胞免疫应答反应[13]。Tim-3作为一种免疫抑制分子，在包括T细胞、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞等多种免疫细胞上均有表达。在对荷瘤小鼠的研究中发现，抗Tim-3抗体可减弱小鼠对抗PD-1治疗产生耐药性[24]。也有研究表明，给感染日本血吸虫的小鼠注射Tim-3-Fc融合蛋白，表达IFN-γ的CD4+T细胞的比例会增加，表明Tim-3抑制了机体的Th1型免疫反应[11]。本研究发现，在感染疟原虫后小鼠脾和外周血T细胞和NK细胞表达的Tim-3的水平均出现升高趋势，虽然Tim-3分子在外周血CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞表面的表达均呈现了先升高后降低的趋势，但感染末期Tim-3分子的表达量仍高于未感染小鼠。有研究表明，Tim-3在抑制细胞因子(如TNF和 INF-γ)的表达方面也发挥着关键作用[25]。在多发性硬化和结肠直肠癌的小鼠模型中，Tim-3和IL-10的升高伴随着IFN-γ和TNF-α表达的减少[26]。此外，由Th2细胞产生的IL-10也可抑制IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌，并降低树突状细胞的抗原提呈和MHC Ⅱ 类分子表达[27]。也有研究发现，在约氏疟原虫感染的小鼠中，IL-10和TGF-β的产生与高寄生虫血症和严重贫血有关[28]。在本研究中，Tim-3分子的持续升高表达以及血清中IL-10的急剧持续升高可能是引起IFN-γ、TNF-α和IL-6在感染中期和后期逐渐降低的原因之一。表明感染后期，机体的免疫抑制过程加剧，这也可能是机体免疫反应最终未能成功杀灭疟原虫的原因之一。

4 结 论

综上，本研究结果表明，感染疟原虫后，小鼠的T细胞与NK细胞介导的免疫应答反应发挥了一定的杀伤作用，在感染前期有一些促炎细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6参与了抗疟原虫免疫，但由于Tim-3免疫检查点分子及一些发挥免疫抑制作用的细胞因子(IL-10)的过度表达，推测这可能导致小鼠在感染后期处于过度的免疫抑制状态，从而有利于疟原虫逃避宿主的免疫捕杀作用。这提示从宿主免疫抑制角度出发，针对抗疟原虫免疫反应方面设计药物具有重要意义。