屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽生长性能、屠宰性能和免疫功能的影响

2022-11-29韩鹏敏边世雄李云雷倪爱心王园美宗云鹤赵金蒙袁经纬孙研研李建慧陈继兰

畜牧兽医学报 2022年11期

韩鹏敏，张然，边世雄，李云雷，倪爱心，王园美，宗云鹤，赵金蒙，袁经纬，孙研研，李建慧，陈继兰*，麻慧*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室，北京 100193；2.山西农业大学动物科学学院，太谷 030801)

益生菌被认为是一类对宿主有益的活性微生物，能够通过改善和塑造肠道微环境，有效抑制肠道病原菌的定植，使家禽保持健康[1]。益生菌自身产生的抗菌化合物，可对竞争性肠道病原菌发挥直接抗菌作用[2]。Abdel-Hamid等[3]在体外试验中研究发现，屎肠球菌产生的细菌素可以在体外抑制金黄色葡萄球菌的增殖，且该细菌素能够减轻金黄色葡萄球菌感染大鼠后的组织器官损伤。已有研究发现，枯草芽孢杆菌可改善肉鸡的生长性能和免疫功能，并调节盲肠微生物菌群[4]。目前，家禽生产中常用的益生菌有乳酸菌、芽孢杆菌和肠球菌等[5]。本课题组前期研究发现，在健康成年鸽的嗉囊和肠道中存在大量屎肠球菌，且屎肠球菌在肠道内具有较强的定植优势。屎肠球菌属于革兰阳性乳酸菌，兼性厌氧，无荚膜，无芽孢，是存在于人和动物肠道中的主要菌群之一[6-7]。屎肠球菌可在肠道表面黏附形成保护屏障，其代谢产生的有机酸、细菌素等能够抑制或杀灭病原菌，从而发挥益生作用[8]。枯草芽孢杆菌广泛分布于土壤、植物等环境中，抗逆性较强，易于加工，因此，在商品化生产及动物生产中使用较为广泛。研究发现，枯草芽孢杆菌可提高动物胃肠道内酶的活性，从而提高动物饲粮养分利用率[9]。目前，屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽的影响报道较少。因此，本研究旨在研究单独添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌及二者混合添加对乳鸽生长性能、屠宰性能、免疫功能的影响，从而探究其调控乳鸽生长的作用机制，为益生菌在乳鸽生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用屎肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌112025菌粉均购自河北沧州华雨生物科技有限公司，活菌数分别为3×109、2×1010CFU·g-1。试验种鸽及乳鸽品种为山西某肉鸽养殖企业饲养的白羽王鸽。试验过程中涉及的动物饲养及乳鸽屠宰均遵照《Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching》中的原则和具体指南[10]，并经中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物实验福利伦理委员会批准(批准参考编号：IAS2021-98)。

1.2 试验设计及饲粮配方

试验选取240只12日龄、体重接近的健康白羽王鸽，公母各120只，随机分为4组，每个组6个重复，每个重复10只乳鸽，试验期16 d。人工哺育，对照组(A组)饲喂基础饲粮(表1、表2)；屎肠球菌组(B组)在基础饲粮中添加屎肠球菌，有效活菌数为1.11×107CFU·mL-1；枯草芽孢杆菌组(C组)在基础饲粮中添加枯草芽孢杆菌，有效活菌数为7.4×107CFU·mL-1；混合组(D组)在基础饲粮中添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌，屎肠球菌有效活菌数为1.11×107CFU·mL-1，枯草芽孢杆菌有效活菌数为7.4×107CFU·mL-1。基础饲粮的组成和营养成分见表1和表2。鸽舍温度维持在29～32 ℃，定期观察鸽群精神状况、病死情况并做记录。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

表2 颗粒料主要原料及营养水平(风干基础)

1.3 样品采集

于乳鸽28日龄时，每个重复随机屠宰2只乳鸽。血清：颈部采血并分离血清，将血清分装至1.5 mL离心管中，迅速放入-20 ℃保存。

胸肌：屠宰后，采集左侧胸肌保存于4 ℃冰箱中用于肌肉品质指标测定。

肝：屠宰后，采集肝组织于液氮速冻后转至-80 ℃冰箱保存。

免疫器官：处死乳鸽后迅速剖开腹腔，摘取胸腺、脾和法氏囊，剔除脂肪组织，吸干表面水分并称重。

1.4 指标测定

1.4.1 平均日增重分别于乳鸽12和28日龄称重并记录，以每个重复为单位，计算各组乳鸽的平均日增重(ADG)。

1.4.2 屠宰性能和肌肉品质剥离腹脂、双侧胸肌和腿肌并称重，参照NY/T823—2020测定乳鸽屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率。采集左侧胸肌，参照朱丽慧等[11]的方法测定胸肌肉色、pH和滴水损失。

1.4.3 血清生化、免疫指标血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)的含量使用相应试剂盒测定，并通过TP和ALB计算球蛋白(GLB)和白球比(A/G)。所用测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，具体测定步骤按照试剂盒说明书进行。

血清中免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)的含量采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定，委托北京莱博泰瑞科技发展有限公司测定。

1.4.4 肝组织抗氧化指标肝中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，测定步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 免疫器官指数根据公式：免疫器官指数(%)=[免疫器官重(g)/乳鸽活体重(g)]×100，计算胸腺、脾和法氏囊器官指数。

1.4.6 肝组织生长相关基因表达量从-80 ℃冰箱中取出冷冻保存的肝组织样品，按照TRIzol试剂盒(Invitrogen，USA)说明书步骤提取总RNA，用核酸定量仪NanoDrop ND 2000分光光度计(Thermo，USA)检测RNA的浓度和质量。cDNA反转录参照PrimeScript RT试剂盒(RR047a，TaKaRa，日本)说明书进行。按荧光定量测定，反应体系为10 μL：TB Green Premix EX Taq 5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，50(ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.5 μL，加ddH2O至10 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 32 s，40次循环；熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以对照组乳鸽肝的基因表达量为基准，以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算肝中生长相关基因生长激素(GH)、生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因的相对表达量。基因引物序列见表3，并由生工生物工程股份有限公司合成。

表3 PCR引物序列

1.5 统计分析

数据经Excel 2010分析后，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Tukey法进行多重比较。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著，所有检验结果均以“平均值(标准差(Mean(SD)”表示。

2 结果

2.1 乳鸽平均日增重

由图1可知，与对照组相比，屎肠球菌组显著提高了12～28日龄乳鸽平均日增重(P<0.05)，而枯草芽孢杆菌组显著降低了乳鸽平均日增重(P<0.05)，混合组对乳鸽的平均日增重无显著影响(P>0.05)。

A. 对照组；B. 屎肠球菌组；C. 枯草芽孢杆菌组；D. 混合组。图柱上附不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2 乳鸽屠宰性能和肉品质

由表4可知，与对照组相比，3个处理组乳鸽的屠宰率、半净膛率、全净膛率、腿肌率、胸肌率、腹脂率均无显著影响(P>0.05)；由表5可知，与对照组相比，屎肠球菌组和混合组显著提高了乳鸽胸肌亮度(P<0.05)，混合组还显著提高了乳鸽胸肌红度(P<0.05)，但乳鸽胸肌黄度、pH及滴水损失各组间无显著差异(P>0.05)。

表4 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽屠宰性能的影响

表5 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽胸肌肉品质的影响

2.3 乳鸽免疫功能

由表6可知，与对照组相比，3个处理组乳鸽血清中IgA含量有提高趋势，但差异不显著(P>0.05)；而屎肠球菌组、枯草芽孢杆菌组和混合组乳鸽血清中IgG含量显著升高(P<0.05)。由表7可知，与对照组相比，混合组能够显著提高乳鸽胸腺指数和法氏囊指数(P<0.05)，各组间的脾脏指数无显著性差异(P>0.05)。

表6 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽血清免疫球蛋白含量的影响

表7 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽免疫器官指数的影响

2.4 乳鸽血清生化指标和肝组织抗氧化指标

由表8可知，与对照组相比，屎肠球菌组显著提高乳鸽血清中GLB含量(P<0.05)，枯草芽孢杆菌组和混合组对乳鸽血清生化指标均无显著影响(P>0.05)；由表9可知，屎肠球菌组乳鸽肝中SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，混合组肝中GSH-Px活性显著高于对照组(P<0.05)，枯草芽孢杆菌组肝中CAT活性显著高于对照组(P<0.05)，3个处理组对乳鸽肝中T-AOC和MDA的含量无显著影响(P>0.05)。

表8 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽血清生化指标的影响

表9 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽肝组织抗氧化能力的影响

2.5 乳鸽肝组织生长相关基因的表达量

饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽肝组织GH、GHR、IGF-1基因相对表达量的影响如图2所示，3个处理组的肝组织GH、IGF-1基因表达水平显著高于对照组(P<0.05)，枯草芽孢杆菌组肝组织GHR基因表达水平显著高于对照组(P<0.05)，屎肠球菌组和混合组的肝组织GHR基因表达水平与对照组差异不显著(P>0.05)。

图2 屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽肝组织GH、GHR和IGF-1基因相对表达量的影响

3 讨论

3.1 饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽生长性能的影响

乳鸽作为主要消费产品，其生长状况受到广泛关注。使用益生菌能够帮助机体迅速在肠道中形成优势菌群，降低肠道疾病的发生，促进乳鸽健康生长。Han等[12]研究表明，饲粮中添加微囊化粪肠球菌CG1.0007可提高肉仔鸡的生长性能，改善健康状况。陶振阳等[13]研究发现，在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加粪肠球菌可提高蛋鸡的生产性能，改善肠道形态结构。袁文华等[14]研究表明，在种鸽饲粮中添加丁酸梭菌和乳酸菌能促进乳鸽生长，且丁酸梭菌和乳酸菌复合添加的效果优于单一添加。本研究发现，与对照组相比，屎肠球菌组乳鸽12～28日龄平均日增重显著提高，与前人研究结果一致。这可能由于屎肠球菌在机体内大量定植，改善动物的消化吸收能力，提高消化利用率，从而提高乳鸽平均日增重[15]。

贡筱[16]研究发现，饲粮中添加1×1010CFU·kg-1的枯草芽孢杆菌，蓝狐的营养物质消化率、氮沉积、净蛋白质利用率、蛋白质生物学价值较为理想，且可获得较好的生长性能。而本研究中添加枯草芽孢杆菌降低了乳鸽平均日增重，可能与其添加量或乳鸽特殊的消化系统有关。

3.2 饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽屠宰性能和肉品质的影响

屠宰性能是反映肉用动物体内不同组织及同一组织不同部位营养物质沉积量的重要指标，直接影响乳鸽的销售价值。Mao等[17]研究发现，DGAT2基因与鸽子的胴体性状和肉质性状关系密切，G18398T和G22484C的SNPs可作为鸽子标记辅助育种的遗传标记。樊海苗等[18]研究显示，饲粮中添加复合益生菌对北京油鸡的屠宰性能无显著影响。Rehman等[19]在肉鸡饲粮中添加益生菌发现，对屠宰率、胸肌率和腿肌率没有显著影响。本次试验对乳鸽屠宰性能测定结果显示，屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽的屠宰率、半净膛率、全净膛率、腿肌率、胸肌率、腹脂率均无显著影响，与前人研究结果一致。

肌肉pH与糖酵解速率有关，糖酵解越快，产生的乳酸越多，pH就越低。pH处于正常范围内，有助于增强肌肉风味。卜柱等[24]研究表明，鸽肉pH在5.90～6.05之间，属于正常范围，且乳鸽肉的pH略高于老鸽肉。而何翔等[27]报道21日龄白羽王鸽的pH为5.68。本研究中，屎肠球菌和枯草芽孢杆菌不影响乳鸽胸肌pH，乳鸽的pH均在5.70～5.80之间。滴水损失是评价肉品保水能力的重要衡量标准之一，与肌肉中结缔组织含量有关，结缔组织越丰富，肌肉保水能力越强。肌肉的保水性会直接影响肉的滋味和嫩度，具有重要的经济意义[28]。Nduku等[29]研究发现，饲粮添加益生菌显著降低了肉仔鸡胸肌滴水损失率。而Park和Kim[30]在肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌发现胸肌滴水损失增加，具体原因尚不清楚。本研究显示，饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽胸肌滴水损失无显著影响。

3.3 饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽免疫功能的影响

胃肠道中的微生物种类繁多，在黏膜免疫系统中发挥重要作用。口服益生菌能够通过Toll样受体与肠道上皮细胞或固有层相关免疫细胞相互作用，并减少细胞因子或趋化因子的产生[31]。IgG是血清浓度最高的免疫球蛋白，约占70%～80%，不仅含量多，作用时间也长，在抗体介导的防御反应中起主要作用[32]。IgA在血清中含量仅次于IgG，主要存在于黏膜组织。贺濛初等[33]研究表明，饲喂益生菌可提高肉仔鸡血清中IgG、IgM的含量，并且通过Toll样受体通路蛋白表达提高机体免疫力。陈功义和郝振芳[34]研究显示，乳酸菌微生态制剂能够提高白羽王鸽血清IgG含量。本研究发现，添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌均不同程度提高乳鸽血清中IgA和IgG的含量，与前人研究结果一致。

免疫器官的生长发育是判断乳鸽免疫力强弱的重要指标，胸腺、脾和法氏囊的重量和相对重量越大，表明禽类机体的细胞免疫和体液免疫机能越高[35-36]。李龙等[37]研究表明，饲粮添加益生菌显著提高了育肥期肉鸡的脾脏指数。Chen等[38]研究发现，给肉仔鸡饲喂干酪乳杆菌和植物乳杆菌可显著提高胸腺指数、脾脏指数。史自涛等[39]研究发现，饲粮中添加1 000 mg·kg-1的粪肠球菌后断奶仔猪脾脏指数比对照组提高19.70%。Guo等[40]研究结果显示，饲粮中添加枯草芽孢杆菌显著增加了樱桃谷肉鸭的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数。本试验结果表明，屎肠球菌和枯草芽孢杆菌可显著提高乳鸽胸腺指数、法氏囊指数，且混合添加效果优于单一添加。

3.4 饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽血清生化指标的影响

血清总蛋白和白蛋白能够反映肝的代谢能力以及对蛋白质消化利用的程度。本研究表明，饲喂屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽血清总蛋白和白蛋白的含量无显著影响，说明饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌不会对乳鸽肝组织造成损伤。俸祥仁等[41]研究显示，乳鸽饮水中添加益生菌对血清总蛋白和白蛋白无显著影响，与本研究结果一致。存在于动物血清中的球蛋白具有免疫作用，并且能够反应机体对碳水化合物的吸收程度和营养水平。本研究发现，饲粮添加屎肠球菌可显著提高乳鸽血清中球蛋白的含量，可能与其提高乳鸽血清中免疫球蛋白含量有直接关系，其余血清生化指标均无显著变化。陈晓帅等[42]研究表明，饲粮中添加复合益生菌显著降低了28～56日龄白羽王鸽血清总胆固醇、甘油三酯、白球比和尿素氮的含量。与本研究结果不一致，原因可能是饲喂方式、乳鸽日龄及益生菌添加的种类不同。

3.5 饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽肝组织抗氧化指标的影响

动物体内SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC和MDA含量或活性是衡量机体抗氧化能力的重要指标[43]。黄丽卿等[44]研究表明，饲粮添加屎肠球菌可缓解禽大肠杆菌O78感染导致的肉鸡抗氧化状态失衡。彭豫东等[45]研究发现，饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够显著提高石门土鸡血清中GSH-Px活性。袁文华等[46]通过在青年鸽饲粮中添加丁酸梭菌和乳酸菌发现，益生菌组显著提高青年鸽肝组织中CAT、SOD、GSH-Px活性。本试验研究发现，饲粮中添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌均不同程度提高乳鸽肝组织中SOD、GSH-Px、CAT活性，与前人研究结果一致。这可能是由于屎肠球菌和枯草芽孢杆菌能代谢产生SOD和GSH等抗氧化酶或非酶抗氧化剂，通过调节肠道内环境清除体内过量的自由基，但其具体作用机理有待进一步探究。

3.6 饲粮添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对乳鸽肝组织生长相关基因表达量的影响

GH至IGF-1途径是动物生长发育的中心环节，只有GH与靶细胞上的GHR结合，通过细胞内的信号转导机制，使靶细胞分泌IGF-1，通过血液运输到全身，以调控机体生长。肝是生长激素-胰岛素样生长因子轴(GH/IGF-1 axis)的载体，是GHR基因表达量最高的器官，也是IGF-1分泌的主要场所[47]。李天杰[48]对蛋鸡的研究发现，饲粮中添加戊糖片球菌可显著提高蛋鸡肝中GH和GHR的表达量，添加枯草芽孢杆菌显著降低了蛋鸡卵巢中PRLR的表达量和肝GHR的表达量。本试验发现，乳鸽灌喂料中单一及混合添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌可显著提高肝组织中GH和IGF-1基因表达水平，添加枯草芽孢杆菌显著提高了乳鸽肝中GHR的基因表达量，可能与其提高肝中CAT活性和血清免疫球蛋白含量有关，具体作用机制有待进一步研究。Tanaka等[49]研究表明，鸡肝中IGF-1基因表达呈GH依赖模式，而在其他组织中的表达并不依赖于GH的作用，本研究结果也显示IGF-1基因的表达与GH表达量之间存在依赖关系。