联合粪便微小染色体维持蛋白2检测和多靶点粪便 FIT-DNA 联合检测技术在筛查结直肠癌的意义＊

何柏霖 袁宇林 刘敏 张健 程书榜△

（1.深圳市龙华区人民医院胃肠外科，广东 深圳 518000）

（2.广东医科大学研究生院，广东 湛江 524000）

结直肠癌是作为全球第三大常见癌症，是消化系统的常见恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第二大主要原因[1]，严重危害着人类健康。若能对结直肠癌进行早期筛查、早发现、早治疗，结直肠癌患者的五年生存率可达80%以上[2]。发达国家得益于对人群结直肠癌筛查项目和危险因素控制开展较早，其结直肠癌发病率以及死亡率均持续下降[1-2]。常见的筛查方式包括：粪便隐血，免疫法粪便隐血试验（FIT）-DNA检测；肠镜；问卷评估等。肠镜获取病理诊断是筛查的金标准，但中国人口基数大，完成肠镜筛查所需周期长，病变检出率低，受检人群不够浓缩。加上肠道准备麻烦痛苦，且为侵入性检查，人群接受度低。为了提高筛查的准确度、人群的接受度，浓缩接受肠镜检查的人群。本研究拟联合粪便微小染色体维持蛋白2检测和多靶点粪便 FIT-DNA 联合检测技术对亚太结直肠癌筛查评分系统（APCS）评分大于2分的人群进行筛查，探讨联合两种筛查技术对结直肠癌筛查的效能。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究为前瞻性、观察性研究。连续性纳入2020年3月至2021年12月于深圳市龙华区人民医院胃肠外科门诊就诊且APCS评分大于2分患者，共600例。

纳入标准：（1）年龄40～74岁；（2）有轻微肠道症状人群，如排便习惯改变、便血、腹胀腹痛、便秘等；（3）有肠癌家族史人群；（4）有既往病史人群，如肠道慢性炎症疾病；（5）肠镜不依从人群；（6）做肠镜有风险人群，如严重糖尿病患者。

排除标准：（1）既往结直肠癌相关手术史；（2）存在肠镜检查的禁忌症，不能耐受肠镜检查者；（3）不愿提供粪便样本；（4）入选前 3 个月内曾经参加过任何药物试验者；（5）有酗酒，吸毒或药物滥用史；（6）研究者认为不适宜参加本临床试验者。共提供600个常卫清检测试剂盒免费筛查。本研究通过深圳市龙华区人民医院伦理委员会审核批准[KY2019106]。所有患者均签署知情同意书。

1.2 筛查方法

1.2.1 多靶点粪便FIT-DNA联合检测

本研究采用诺辉健康科技有限公司提供的多靶点粪便 FIT-DNA 联合检测技术试剂盒（常卫清）。入组人员在专业技术人员指导下学习试剂盒附带的粪便采样视频，并严格按照视频提示标准采样，然后由快递人员上门收取标本送至广州诺辉医学检验实验室进行检测，并出具检测报告，阳性人群建议行全结肠镜检查以确诊，并再次收集粪便标本，检测粪便中微小染色体维持蛋白2（MCM2）的表达量。

多靶点粪便FIT-DNA联合检测技术的工作原理是通过KRAS基因突变、BMP3/NDRG4基因甲基化和血红蛋白的多组学检测手段，经已获得专利且被药监局批准的逻辑回归模型算法进行计算综合评分，得出送检样本结直肠癌风险评估结果。检测评分的分值大于等于165分是阳性结果，分数小于165分是阴性结果。

1.2.2 粪便MCM2表达量的检测

分析结直肠腺瘤患者及腺癌患者粪便中MCM2 mRNA的表达差异（采用William E.Bennett Jr方法在粪便中提取微量MCM2 mRNA）。

（1）100 mg冻存粪便加入1 mL的RNA Bee（美国Tel-Test公司）；（2）离心后的上清液加入酸化的玻璃微球，蛋白核酸提取仪离心（美国Thermo公司提供Fast Prep FP120）；（3）提取液使用德国Qiagen公司提供RNeasy spin column柱子微量提取RNA；（4）实时荧光定量逆转录PCR分析正常人群、结直肠腺瘤患者及腺癌患者粪便中MCM2 mRNA的表达差异。

1.3 统计学分析

使用SPSS 18.0对收集的一般资料和临床资料进行统计学汇总与梳理。计量资料用（x±s）表示，进行t检验；计数资料用[n（%）]表示，进行χ2检验。多个样本均数讲的比较用SNK-q检验。约登指数=敏感度+特异度-1。约登指数：是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性（漏诊率）和假阳性（误诊率）的危害性同等意义时，即可应用约登指数。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力，指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 各检测技术单独检测结果

多靶点粪便 FIT-DNA联合检测技术试剂盒初筛阳性结果80例，初筛阳性患者在进行肠镜检查的同时，再留取粪便标本进行MCM2检测。病理结果提示阳性（结直肠癌）8例，阴性72例，见表1。

表1 各检测技术单独检测结果

2.2 不同检测方法的诊断价值比较

病理学金标准诊断80例经过FIT-DNA初筛阳性中8例为结直肠癌。经MCM2单独检测，80例初筛阳性中，阳性33例，阴性47例；两种方法联合检测，80例初筛阳性患者中阳性19例，阴性61例。MCM2检测与 病理学诊断比较，有差异（P＜0.05，表2）；联合检测与病理学诊断比较，有差异（χ2=9.091，P＜0.05，表3）；两种筛查技术联合检测与MCM2检测比较，有统计学意义（χ2=3.84，P＜0.05，表4）。联合检测的约登指数为84.72%，见表5。

表2 MCM2检测单独检测的诊断价值[n（%）]

表3 联合检测的诊断价值[n（%）]

表4 MCM2单独检测和联合检测

表5 不同检测方法的诊断价值比较

2.3 MCM2在不同组织的表达量

荧光定量逆转录PCR检测结果示：MCM2在正常结直肠黏膜、腺瘤、结直肠癌粪便中的表达量分别为（1.103±0.901）、（17.150±4.125）、（47.070±4.551），结果显示任意两组间总体均数差异有统计学意义（P=0.026，见表6）。

表6 MCM2在不同组织的表达量

3 讨论

随着社会经济的发展，人们的生活方式发生了变化，且人口老龄化逐渐增大，全球每年新增的恶性肿瘤，大约有1/10为结直肠癌，位居世界癌症第三位。2016 年中国癌症统计数据显示：中国新发的癌症约406万例，其中结直肠癌占比40.8%，位居第二位[3]。因此结直肠癌的防治工作刻不容缓。当前，世界卫生组织已把结直肠癌列为最适合进行早期筛查和预防的癌症之一，如何强化早期筛查、防治已成为社会各界的共识。在早期预防措施中，早诊筛查的作用特别重要，是抑制结直肠癌高发的重要手段。世界各发达国家已做了相关的工作并取得了明显的效果[4-6]。

近几年多靶点粪便FIT-DNA联合检测逐步发展成熟，将粪便 DNA分子技术和免疫法粪便FIT结合起来，不但使FIT对结直肠癌筛查的敏感度得到进一步的提升，同时也对结直肠发展期腺瘤筛查的敏感度也有了很大的提升。美国的研究表明，多靶点粪便FITDNA联合检测对进展期腺瘤敏感性高达42%[7-8]。多项研究表明[9-10]，常规体检人群筛查中，阳性率在10%左右。我们对亚太结直肠癌筛查评分系统（APCS）[11]评分大于2分的人群进行筛查发现，阳性率为13.3%。然而筛查阳性的这80例患者中，经过肠镜检查，病理确诊为结直肠癌的仅8例。肠镜检查的顺应性差，肠道准备较麻烦，且是侵入性操作，患者的接受度低，这些均会成为肠镜筛查的障碍，且增加患者的痛苦。能否通过进一步的无创筛查，浓缩接受肠镜检查的人群成为我们研究的重点。

目前已有的研究表明，MCM2是细胞周期阶段的特异性标记，在进入细胞周期的细胞中都存在表达，但是在分化成熟的细胞和静止期（G0期）细胞中，MCM2不表达[12-15]。因此，MCM2能作为细胞增殖标记物来标记增殖发育细胞中产生的异常和突变，其特异性能比常规增殖标记物 PCNA和 ki-67更好，并且多项研究证实，MCM2的细胞表达阳性与细胞发育异常的严重性相关，MCM2在结直肠腺瘤的腺上皮组织中也有高表达，尽管MCM2在结直肠腺瘤和腺癌组织中的表达部位没有显著的差别，但是二者在MCM2表达量上存在着统计学差异[16-20]。这就为通过定量检测结直肠癌患者及结直肠腺瘤患者粪便中MCM2的表达差异提供了可能。

我们对多靶点粪便FIT-DNA联合检测的患者再次留取粪便，检测粪便中的MCM2 mRNA在正常人群、腺瘤及结直肠癌中的表达差异，实验证明表达量差异有统计学意义。以往的研究显示，MCM2在分化成熟、静止阶段的细胞中没有表达[21-22]。MCM2在胃癌的研究中显示[23-24]，微小染色体维持蛋白对病人的预后有一定的影响，而在胃部腺瘤和腺癌中，其表达存在着差异性[25-26]。大肠中关于MCM2在大肠正常上皮组织、大肠腺瘤和大肠癌组织的表达状况进行了探讨，发现腺瘤中MCM2的表达量比正常组织要高，但比癌组织要低[27]。

我们的实验表明，在多靶点粪便FIT-DNA联合检测初筛阳性的患者，再进行粪便MCM2检测，对结直肠癌筛查的敏感度可达100%，特异度为84.72%。多靶点粪便 FIT-DNA 联合检测技术以及粪便微小染色体维持蛋白2检测应用于结直肠癌患者的初筛具有一定的临床价值，两种方法均具有重复性强、客观性高、简便易行的优势。将两者联合检测可提升筛查的敏感度、特异度和约登指数，可作为筛查、诊断结直肠癌的重要辅助手段，能让接受肠镜检查的患者更加浓缩，减少患者的痛苦，节约有限的医疗资源。相对于结肠镜来说，在多靶点粪便FIT-DNA联合检测初筛阳性的患者，再进行粪便MCM2检测，受检者痛苦小，居家取样方便，不但节省了医疗资源，还增加了人们的依从性，同时大幅度减小了肠镜检查所造成的出血、穿孔等并发症的发生。